基于微流控集成芯片的肿瘤干细胞筛选新方法

The separation of cancer stem cellls is the foundation of the investigation of cancer stem cells. It is very challenging to establish an efficient, high throughput and low-damaged method for the separation of cancer stem cells.On the basis of an integrated microfluidic chip, we will develop a new method to separate cancer stem cells from HepG2 cells. The integrated microfluidic chip consists of microvalves and two functional components, with the capability of efficient cell mixing and cell focusing. After the optimization of the functional components by designing structures,simulating fluid field and experimentally evaluating， and separation conditions by adjustment of antibody concentration, fluid velocity and cell density, with the antibody modification of microchannel surface, cancer stem cells can be efficiently captured and high-throughput enriched without damage in the efficient cell mixing and the cell focusing components, respectively.With the characterization of the enriched cancer stem cells on molecule, cell and animal levels, the new method for the separation of cancer stem cells is established. This method can not only provide the quantitative information of cancer stem cells, including the number and the proportion of cancer stem cells in samples, but also provide a large number of enriched cancer stem cells. This method has the potential application to separation, investigation and diagnosis of cancer stem cells.

肿瘤干细胞筛选是进行肿瘤干细胞研究的基础，建立高效、高通量、低损伤的的肿瘤干细胞筛选新方法，是非常具有挑战性的课题。本项目以具有细胞高效混合和细胞聚焦双重功能的微流控集成芯片为平台，以人类肝癌细胞HepG2为研究对象，建立肿瘤干细胞筛选新方法。通过对细胞高效混合功能单元和细胞聚焦功能单元的设计、流场模拟和实验验证，实现对功能单元的优化。整合微型阀门，制备具有最佳效果的微流控集成芯片。基于制备的微流控集成芯片，结合抗体修饰通道表面，通过优化抗体浓度、流速和细胞密度，实现对肿瘤干细胞的高效捕获和高通量、低损伤富集。在分子水平、细胞水平和整体动物水平，对富集的肿瘤干细胞特性进行评估，完善肿瘤干细胞筛选新方法。本方法在提供肿瘤干细胞数量和比率等定量信息的同时，能够提供大量具有活性的肿瘤干细胞。以期为肿瘤干细胞筛选、研究、诊断提供新的方法。

肿瘤干细胞筛选是进行肿瘤干细胞研究的基础。建立肿瘤干细胞筛选和富集的新方法，并对筛选得到的肿瘤干细胞进行表征，进而对其进行基因水平研究，是非常具有挑战性的课题。本项目开发基于细胞高效混合和细胞聚焦双重功能的微流控集成芯片，用于肿瘤干细胞富集；也开发了具有上万个微井结构的芯片平台用于肿瘤细胞干性富集培养；为了实现对富集的肿瘤干细胞进行基因水平表征，本项目也尝试进行单细胞水平基因表达研究。以细胞聚焦芯片为基础，利用海藻酸钠修饰微流控芯片通道表面。通过EDC和NHS催化反应，将具有氨基的PEG和抗体先后修饰在通道的海藻酸钠表面。结合EDTA缓冲液冲洗，实现了微流控通道表面抗体的可释放修饰。利用这一芯片和抗体修饰结合平台，将人类肝癌细胞HepG2中肿瘤干细胞进行筛选，并实现肝癌肿瘤干细胞回收。利用微加工方法，在PDMS表面上，加工了万个微井结构。PDMS底面的微井结构能够均匀地分散细胞。在确保A549细胞具有较高活性的前提下，实现了人类肺癌腺癌细胞A549高密度干性培养。成功地对肺癌肿瘤干细胞实现了富集。在基因表达水平、细胞水平以及动物水平，对筛选和富集得到的肿瘤干细胞的干性进行了评估。由于肿瘤细胞中具有极强的异质性，为了能够更为准确地、科学地描述和研究肿瘤干细胞中基因表达异质性情况，本研究还尝试建立了基于单细胞基因表达检测的方法，对于富集得到的肺癌肿瘤干细胞进行单细胞基因表达检测。本研究建立了肿瘤干细胞筛选和富集的新方法。在对富集得到的肿瘤干细胞进行基因、细胞和动物水平评估的同时，建立了单细胞水平肿瘤干细胞干性进行表征的技术手段。本研究实现了从肿瘤干细胞筛分、富集、表征到单个肿瘤干细胞基因表达研究的整个过程，为肿瘤干细胞研究提供了新的技术手段。相信会对该领域的研究发展，起到了重要地、积极地作用。