应用NOD/SCID.e2f1小鼠模型研究FomA蛋白在牙周致病菌生物膜形成中的作用

A dental plaque biofilm,is an essential component of periodontal disease. Bacterial coaggregation is necessary during the early stage of biofilm formation. Therefore, blocking coaggregation is a suitable strategy for the prevention of periodontal disease. Fusobacterium nucleatum, colonises the plaque biofilm im the early stage, is considered to be the most important bio-bridge involved in the formation of plaque biofilm. Studies have shown that periodontal pathogens of weaker adhesion ability can form film with copolymerization with Fn, Our preliminary research suggests, FomA, the major outer membrane porin protein in Fn, is a candidate target in inhibiting periodontal biofilm formation. But the evidence is lack, and the mechanism is not clear. In this project, we proposed to construct the FomA defect strains, through the establishment of biofilm in vitro madel, periodontal pathogens and and gingival epithelial cells co-culture and gingival abscess in mice model experiments in vivo, to research the role of FomA protein in oral biofilm formation, in mediating Fn with periodontal pathogens copolyme to enhance the pathogenicity. At last, We propose to use NOD/SCID.e2f1mice model, to construct the biofilm and to resersch the mechanism, and to evaluate the value of effective targets for inhibition of bio-film formation.

菌斑生物膜是牙周炎发生的始动因子，具核梭杆菌（Fn)是菌斑形成过程中的桥梁菌，它可以与粘附能力弱的牙周致病菌共聚形成生物膜，协助致病菌发挥致病作用。Fn的外膜FomA 蛋白可能在此过程发挥重要作用，但相关实验数据缺乏，作用机制不明确。本项目拟构建Fn的fomA 基因缺陷株，选取Pg ATCC 33277 、Aa Y4作为实验菌株，以KB细胞系作为实验细胞，体外生物膜、细菌粘附及侵入细胞等实验研究FomA 在牙周致病菌与Fn共聚过程中发挥的作用，分析FomA 蛋白对牙周致病菌粘附、侵入及刺激上皮细胞分泌炎性因子能力的影响，并初步探讨其作用机制；最后应用NOD/SCID.e2f1 小鼠模型模拟人类口腔系统，体内研究FomA 蛋白对牙周致病菌生物膜形成的影响，初步分析唾液蛋白在此过程中可能发挥的作用，探索该模型在牙周生物膜相关研究中的价值，为评估FomA蛋白作为牙周生物靶点的价值提供理论依据。

具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, Fn）是与牙周病密切相关的致病菌之一，定植于菌斑生物膜形成的早期阶段。在牙周生物膜的形成及牙周致病菌致病的过程中，Fn起着十分重要的作用，寻找阻断其黏附及与其他致病菌共聚的方法，有可能是控制菌斑形成的有效途径。细菌的特异性粘附与共聚，要通过粘附位点的参与来完成。FomA 蛋白是Fn的主要外膜孔道蛋白，具有调节细胞内外电压、调节免疫反应等功能。少量研究显示阻断FomA蛋白可能会抑制致病菌生物膜的形成，降低其在牙体硬组织及口腔黏膜表面的粘附能力，最终降低致病菌对牙周组织的损伤能力。但目前关于FomA相关功能及其免疫原性、免疫效果的研究较少，直接及相关证据更为缺乏。.本研究通过基因重组技术，构建了具核梭杆菌FomA基因的缺陷株，通过体外生物膜、细菌粘附等实验研究了该缺陷株的生物学特性。结果显示该突变株的生长、增值及其缓慢，黏附能力极大下降，我们推测FomA 蛋白的缺失，影响了该细菌的正常发育，改变了其生物学特性，提示该蛋白可能是Fn 的必不可少的重要功能蛋白。FomA缺陷株的生物徐特性的改变，为我们后续的实验带来了较大困难，并可能影响到实验结果的准确性。因此，课题组利用大肠杆菌表达系统，表达并获得了一定数量的纯化FomA蛋白，利用该蛋白制备了多克隆抗体，通过体外与Fn的FomA蛋白位点相结合的方式，尝试阻断了该蛋白的功能，再通过体外生物膜、细菌粘附及侵入细胞等实验研究了FomA 蛋白在牙周致病菌与Fn共聚过程中发挥的作用。另外，课题组还尝试利用纯化的FomA 蛋白免疫小鼠，检测其免疫原性及免疫水平，并利用获得 FomA蛋白免疫的小鼠构建牙龈脓肿模型，体内实验检测该免疫方式降低牙周致病菌Fn及牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)感染的效果。