诺如病毒GII.4流行株衣壳蛋白分子进化机理的研究

The periodic GII.4 norovirus outbreaks and pandemics have become increasingly serious public health issues worldwide, while the underlying mechanisms are still not clear. Though previous studies revealed that antigenic drift and receptor switch may promote GII.4 persistance in human population, the variation patterns of the key epitopes on the capsid have not been clarified. In order to elucidate the evolutionary mechanisms governing the persistance of GII.4 norovirus variants, the current study centers on major capsid protein (VP1) of GII.4 norovirus and the molecular evolution models of VP1 is going to be established for determining the key amino acid sites and predicting the evolutionary trend of the GII.4 strains. The major capsid proteins (VP1) of the pandemic GII.4 strains will be expressed in vitro and monoclonal antibodies will also be constructed. For verifing the key molecular epitopes associated with immune evasion, the antigenicity screening platfom will be established with human monoclonal antibody. The covariation of major (VP1) and minor (VP2) viral capsid proteins in norovirus GII.4 strains will be determined. The role of VP2 in regulating the expression and stability of the viral capsid protein was discussed for better understanding the underlying mechanisms of the covariation of VP1 and VP2 in GII.4 norovirus strains. The evolutionary mechanisms governing the persistance of GII.4 norovirus variants will be further elucidated and the key molecular epitopes associated with immune evasion will be determined through the above research. The study may also help to establish a research basis for vaccine design and epidemics control.

诺如病毒GII.4流行株在世界范围内引发的急性肠胃炎周期性大流行已成为日益严重的公共卫生问题，但相关分子机理仍未阐明。研究表明，抗原性漂变和受体识别模式的转换与流行株的扩散密切相关，但关键分子靶标和功能位点的变异规律目前均不清楚。本项目将以主要衣壳蛋白(VP1)为研究中心，首先构建VP1蛋白体外分子进化模型，分析影响病毒功能与抗原性的关键氨基酸位点，预测流行株进化趋势。同时系统表达各时期流行株VP1蛋白并构建单克隆抗体，建立体外抗原性筛选平台，推测各个时期流行株实现免疫逃逸的关键分子靶标和功能位点。并明确流行株主要(VP1)和次要(VP2)衣壳蛋白间的共进化现象，同时从VP2对衣壳蛋白表达量及整体稳定性的影响两个方面探讨VP1和VP2衣壳蛋白的共进化机理。通过本课题研究可进一步阐明GII.4流行株引发周期性大流行的分子机理，明确相关的分子靶标，为疫苗的研发和疫情的防控提供重要的理论支撑。

诺如病毒（norovirus，NOV）是一种引起急性肠胃炎的病原体，GII.4基因型的诺如病毒株在世界范围流行中占主导地位。近年来的研究表明，诺如病毒GII.4病毒株的主要衣壳蛋白VP1突变是GII.4病毒株逃避免疫的重要因素。现阶段多数研究均以VP1为对象，而次要衣壳蛋白VP2的功能与变异机制尚不明确。本课题运用生物信息学技术对188条VP1全长序列的比对分析，P2区是GII.4流行株VP1蛋白分子进化的关键区域，进化趋势与VP1全长基因高度一致，VP1序列的位点变异主要位于P2区；正向选择分析共检出13处关键信息位点，其中9处集中于P2区。以近期流行株Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012为主要研究对象，不同流行株表现受体亲和的广嗜性，抗原性漂变持续存在，构建特异性单克隆抗体，初步确认病毒株抗原性漂变的关键氨基酸位点。这些结果进一步阐明GII.4流行株逃避群体免疫而导致周期性大流行的分子机理，为多效价保护性疫苗与新型药物的设计提供重要的理论基础。另一方面，通过构建真核细胞的表达体系，对VP1和VP2蛋白相互作用的研究显示VP1和VP2均能显著促进对方的表达，进一步研究发现单独的VP1蛋白分散在整个细胞中，而VP2蛋白则具有核定位的功能。在VP1和VP2共同存在的情况下，VP1通过VP2介导亦能定位在细胞核，提示VP2可能在功能和结构上对VP1的功能和位置变化至关重要，VP1可能在VP2协同下通过影响细胞核下游转录信号和染色质重构而在细胞功能方面发挥关键影响作用。这些结果为诺如病毒的防治提供新的思路，即可通过阻断VP1和VP2蛋白之间的相互作用或者阻断VP2蛋白的入核过程来治疗诺如病毒感染引起的急性肠胃炎。