食源性诺如病毒体外进化模拟及其分子机理研究

Norovirus is the main cause of non-bacterial acute gastroenteritis in the world, and shellfish is a well-known source for viral infections. By its high mutation rate, there were several global pandemics caused by norovirus virants in recent 20 years. GII.4 is the major epidemic genotype, by sequence analysis of GII.4 variants appeared over the years, it found that host immunity and histo-blood group antigens (HBGAs) were the key factors for NV persistence in human populations. In our research we will build models of norovirus GII.4 evolution in vitro and find the important animo acid sits for receptor binding and antigenicity, so as to forecast the variation trends..Firse will clone and express capsid protein of norovirus GII.4 detected in shellfish preserved. And then on the basis of the establishment of high-throughput protein expression and function /antigen screening platform, we will accelerate the simulation of viral capsid protein evolution under natural conditions in vitro by directed evolution methods, and screen positive mutants with new function and/or antigenicity. Compared with sequences of initial strains, mutants screend out and variants which were epidemic in history , we will find critical amino acid sites for virus infection, and explore virus evolution mechanisms, which will provide a theoretical basis for monitoring high-risk mutations and risk warning for its spread and outbreak.

诺如病毒是全球非细菌性急性胃肠炎的主要病原之一， 而贝类是病毒感染的重要来源。借助自身的高变异率，近二十年来突变株不断产生并造成多次全球规模的大流行。诺如病毒GⅡ.4型为目前主要流行基因型，通过对历年来出现的变异株序列分析显示，结合宿主受体及逃避人类免疫的能力是病毒长期流行的关键因素。本课题拟针对以上条件建立诺如病毒GⅡ.4的体外进化模型，分析影响病毒功能与抗原性的关键氨基酸位点，达到预测变异趋势的目的。.在获得污染GⅡ.4型病毒的贝类样本基础上，克隆并制备活性衣壳蛋白；建立高通量蛋白表达和功能/抗原性筛选平台，借助体外进化技术，加速模拟自然条件下的病毒衣壳蛋白变异过程，筛选受体结合功能和/或抗原性的突变株；通过突变株的变异位点分析，确定维持感染力的关键氨基酸位点，同时与历史上出现的变异代表株进行比对，探讨病毒进化的分子机理，为监测高危突变株的出现及对其暴发传播进行风险预警提供理论基础。

诺如病毒是全球急性胃肠炎的主要食源性病原，对公共卫生以及食品安全均造成了极大的威胁。合适体外培养和动物感染模型的缺乏阻碍了对诺如病毒的全面认识，目前仍没有有效的病毒疫苗与治疗手段。作为RNA病毒，丰富的遗传多样性被认为是诺如病毒广泛流行的重要原因之一，其中GII.4型作为近二十年来全球主要流行基因型，更是通过自身的不断进化而持续感染人类。本项目以GII.4型诺如病毒的持续进化过程为研究对象，实时跟踪全球诺如病毒变异情况，持续对我国诺如病毒的遗传多样性进行监测，及时掌握了新型GII.4变异株的出现以及主要流行基因型的更替，包括GII.4-2006b、GII.4-2009以及GII.Pe/GII.4-2012等；随着测序技术与信息学的发展，积极开发了三种诺如病毒病毒基因组测序技术，成功积累了22条我国诺如病毒的基因组信息。同时开展了病毒衣壳蛋白的体外研究，制备了具有高亲和性的GII.4型诺如病毒衣壳蛋白抗体；在积累本地病毒遗传信息的基础上，结合全球报道的GII.4型诺如病毒序列，重构了不同流行株的时间相关进化过程；通过同源建模确定各类流行株衣壳蛋白的结构差异，计算关键位点上使用不同氨基酸情况下的免疫原性特点，进而构建了衣壳蛋白上主要抗原表位（A-F）及其氨基酸使用情况的分子档案，探明了影响这种病毒衣壳蛋白结构、功能与免疫原性的关键氨基酸位点的变异规律；此外，从非流行株角度比较了GII.6型和GII.17型变异株衣壳蛋白的免疫原性特点，明确了GII.4型流行株特有的抗原表位（Epi: 369–380），初步阐明了诺如病毒流行株与非流行株间不同的抗原表位分布及分子进化过程。综上所述，本项目系统性地对GII.4型诺如病毒衣壳蛋白进化规律进行了研究，构建了主要抗原表位氨基酸组成与使用的分子档案，初步阐明了GII.4型诺如病毒进化的分子机理，从而为诺如病毒的疫苗及防控策略设计奠定了理论基础。