诺如病毒GII-4流行株进化模型建立及应用的研究

诺如病毒是在世界范围内引起人类急性胃肠炎暴发流行的重要病原。GII-4基因型是诺如病毒引起暴发流行的主要流行株，根据近二十年的分子流行病学数据，诺如病毒与流感病毒相似，每隔几年就出现新的GII-4变异株，引起新一轮全球性胃肠炎大规模流行。由于诺如病毒目前尚无有效的细胞培养和动物模型，其进化和流行机制仍未清楚。本课题拟对我国1991年至今及全球GII-4流行株全基因组序列进行分析，利用共出现网络构建诺如病毒GII-4流行株进化模型，阐明诺如病毒GII-4流行株的进化模式，特别是基因之间或基因内部的进化模式，利用进化模型确定与受体或抗原性相关的共进化位点，并通过受体结合实验及血清学实验进一步验证，建立的模型将应用于新GII-4流行株的监测，为最终筛选诺如病毒候选疫苗株及预防控制诺如病毒大规模流行提供有效的工具。

诺如病毒是引起全球病毒性胃肠炎暴发流行的重要病原体，感染所有年龄组。诺如病毒与流感病毒相似，每隔几年就有新的GII.4变异株出现，引发新一轮全球胃肠炎流行。2012年底，新的GII.4变异株Sydney 2012出现，引起美国、日本、欧洲各国胃肠炎流行。本研究通过3年诺如病毒监测，Sydney 2012变异株在深圳2012年底引起胃肠炎暴发高峰，并在2013年散发病例中成为流行优势株，流行情况与全球报道一致。新的变异株及几个不同年代GII.4变异株基因组序列被获得。本研究通过构建核苷酸共发生网络（Co-occurrence Network）分析全球GII.4型诺如病毒进化模式。利用软件Muscle整理加工所有GII.4诺如病毒全基因组序列，利用软件Cytoscape显示共发生网络并计算网络拓扑特征；进一步编程将网络中的核苷酸对聚类成共发生核苷酸模块，使用软件Expander分析每一个共发生核苷酸模块并从中提取出能揭示病毒的生物学活性的具有协同作用的共变异核苷酸。结果表明，诺如病毒的进化是随时间蓄积的；GII.4诺如病毒网络连接度的变化可以定量地反映病毒抗原性的变化，当网络连接度在某一季节出现了变化高峰时，意味着新的病毒变异株的出现及疫情暴发的可能；病毒的进化是全基因组水平上的共进化；通过对共发生核苷酸模块的分析，找到诺如病毒基因组的各个基因片段中对于病毒进化起关键作用的相应氨基酸位点。我们利用诺如病毒暴发调查研究诺如病毒感染与受体组织血型抗原之间相互作用，结果在发病组和非发病组中均发现非分泌型个体，提示非分泌型个体也能感染诺如病毒。对不同年代GII.4型诺如病毒P粒子进行表达并进行HGBAs结合模式分析，结果表明两个流行时间较长的变异株95/96US株（1995-2002年）和2006b变异株（2006-2012年）较其他GII.4变异株，与唾液具有较高的亲和力，并能与更多的HBGAs寡糖结合。我们对模型导出的与受体结合相关的氨基酸位点进行突变，均失去结合活性，结果表明这些位点均与受体结合有关；另一些位点可以提高或降低结合活性。本研究利用流行病学研究、共发生网络模型及生物学实验阐明了诺如病毒GII.4型流行株的进化规律，为筛选诺如病毒候选疫苗株及预防控制诺如病毒大规模流行提供有效工具。