棉花黄萎病菌致病关键基因的克隆和功能分析

棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb )侵染引起的真菌性维管束系统病害,被称为"棉花上的癌症"，是棉花最严重的病害之一。本申请项目采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）制备棉花黄萎病菌的突变体，使用室内水培棉花孢子悬浮液浸根接种法对致病性减弱或缺失的突变体进行筛选。对于筛选出的目标突变体，申请人拟利用现代遗传学和分子生物学的研究方法系统鉴定、克隆和功能分析棉花黄萎病菌侵染植物的关键基因，为进一步在我国建立具有自主知识产权的棉花黄萎病防治新方法提供基因基础和科学思路。同时通过本项目的开展可以进一步发展和丰富人们对棉花黄萎病菌致病分子机制的认识。

大丽轮枝菌是一种兼性寄生的植物病原真菌, 能够在许多植物包括棉花上引起萎焉病害,对农业生产造成巨大危害。深入解析大丽轮枝菌的致病机理对于建立新的棉花黄萎病防治策略具有重要意义。课题组以新疆棉花强致病力黄萎菌株V592为材料，利用农杆菌介导遗产转化（ATMT）技术构建了一个含15000个转化子的T-DNA插入突变体库，并对部分突变体致病性、生物学性状、拷贝数进行分析。通过对两株致病性严重下降突变体的研究, 鉴定出两个跟致病性相关的基因，分别是编码尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil-DNA glycosylase)的基因VdUDG和编码聚多糖脱乙酰酶的（Polysaccharide deacetylase family protein gene）基因VdpdaAs。研究发现，VdUDG的突变导致了突变体致病性显著下降, 产孢量升高, 丧失微菌核形成功能, 说明VdUDG基因是大丽轮枝菌致病和形成微菌核所必需的。对VdpdaAs的研究发现，大丽轮枝菌中存在三个同源基因，分别命名为VdpdaA1、VdpdaA2 和 VdpdaA3。三个基因的敲除体在产孢量方面都明显下降，敲除突体△VdpdaA1的致病性明显下降且分生孢子梗减少严重。qRT-PCR结果显示，这三个基因在野生型菌株V592中均具有组织表达特异性。以上结果显示，VdpdaAs在大丽轮枝菌的致病、微菌核形成和产孢过程中起着重要作用。