白木香诱导结香的转录组分析及沉香代谢相关基因的克隆

白木香树在物理、化学及真菌的诱导下，分泌具芳香的树脂，形成中国传统中药及香料沉香，其有效成分主要包括倍半萜类，芳香族和2-苯乙基色酮类三类，目前对其形成过程与诱导机理在基因水平未见系统研究。本项目拟对白木香经诱导结香后的结香部位、未结香部位及诱导真菌的转录组进行测序（RNA-seq），获得三者的基因表达谱，筛选差异表达基因，定量基因表达量，并通过Gene Ontology分析，Pathway分析等研究差异基因的功能、互作及参与的代谢途径。选取若干与沉香代谢相关的基因，分别设计引物扩增全长cDNA，克隆入表达载体后在大肠杆菌中表达，初步研究其功能。本项目将通过分析转录组，比较基因表达谱，结合沉香形成中的生理生化变化，从基因水平探索结香机理、沉香代谢途径及真菌与白木香在结香过程中的互作关系。本项目中获得的转录组及克隆的相关基因都为今后的白木香功能基因研究、沉香代谢的生理生化研究奠定坚实的基础。

本研究所需样品为野外环境下的白木香植物上采集获得，同时，白木香次级代谢产物成分复杂，一般的提取方法无法获得总RNA或总RNA降解严重。经过多种方法的尝试及改进，建立了白木香组织RNA的最佳提取方法——改良异硫氰酸胍-CTAB法，大量提取白木香树干中的白木样品及结香样品RNA，可满足转录组测序及表达谱分析要求。.本研究对诱导结香过程中的白木香组织中的白木（W）、过渡（T）、结香（A）、腐木（D）四个部位合并后进行了转录组测序，同时对4个部位分别进行表达谱分析。测序结果理想，丰富了白木香产沉香的转录组信息，为研究白木香倍半萜代谢途径和白木香伤害防御反应机制提供序列信息。对差异基因进行了表达模型的聚类，发现存在4类表达模型，分别为结香上调，结香下调，过渡-结香上调及过渡-结香下调。进一步对聚类的序列进行GO及pathway富集，发现上调的主要是植物防御反应、级别、次生代谢相关基因，下调的基因主要包括植物细胞循环、信号转导、同源重组、细胞形态建成等植物生长分化相关的基因。主成因分析也表明，过渡样品更接近于白木样品，不同于结香样品。.通过分析上述代谢通路中差异表达的基因，确定了两条基因进行克隆，克隆获得两个基因，分别命名为As-SesTPS及As-SesTPS1，并分别对其进行了分析及表达研究。As-SesTPS基因的ORF长1629bp，编码542个氨基酸；As-SesTPS1基因的 ORF长1671bp，编码556个氨基酸。这两个基因均具有倍半萜合成酶的保守结构域RRx8W和DDxxD，聚类到萜类TPSa家族，分别与多条大根香叶烯-D-合成酶及愈创木烯型倍半萜合成酶基因具有较高相似性，两者均在结香部位具有较高的表达水平，显著高于未结香部位的表达水平（p<0.01）。其中进一步通过FPP底物的作用，对其水解产物进行解析，结果显示As-SesTPS及As-SesTPS1的部分活性结构能够催化FPP产生倍半萜类物质，其中还存在沉香特有的倍半萜物质Nerolidol（橙花叔醇），说明这两个基因编码的蛋白均具有催化倍半萜合成的功能。本研究获得的As-SesTPS及As-SesTPS1基因与已报道的倍半萜合成酶基因进行相似性分析，发现它们之间存在较大差异，是新的倍半萜合成酶基因，可能编码不同结构类型倍半萜的合成酶蛋白。