肝脏枯否细胞激活及肝细胞肝癌发病的H3K4组蛋白重建规律及机制

Proinflammatory cytokines, secreted by Kupffer cells (KCs) and other immune cells in liver microenvironment, form complex molecular network to regulate liver inflammation and hepatocarcinogenesis. We found that histone modifying enzyme TrxG regulating macrophage activation and functional differentiation is the key node for the malignant transformation of chronic liver disease. Our study will focus on "The histone remodeling mechanism of liver microenvironment activation promoting hepatocarcinogenesis and screening the key inflammatory pathways", from integrated analysis of the liver chromatin histone methylation and gene expression profiles, using MEN1, MLL and TLR4 gene knock-out mice, to demonstrate the mechanism that TrxG regulates the differentiation and functional activation of KCs, and its crucial function during the malignant transformation of chronic liver disease. We will further reveal the histone methylation covalent modification mechanisms of TrxG regulating the phenotypes of KCs and inflammatory transcription factors, and identify the feed-forward circuit between TrxG and TLR4/IL-6 inflammatory signaling pathway. It will help us to further uncover the mechanism of key molecules and the related regulation network coordinated control liver inflammation malignant transformation from new perspective of chromatin remodeling.

肝脏微环境中的Kupffer细胞（KCs）分泌的前炎症因子调控肝脏炎症及肝癌发病。我们发现，组蛋白甲基化修饰酶TrxG通过组蛋白共价修饰及染色体结构重塑调控KCs的分化及功能活化，是慢性肝病恶性转化的关键节点。本项目围绕“肝脏微环境激活促进肝癌发生发展的染色质组蛋白甲基化重建机制及关键炎症通路筛选”这一科学问题，从已获得的肝脏染色质组蛋白甲基化谱及表达谱芯片数据的整合性分析入手，利用MEN1、MLL及TLR4等关键基因敲除的模式动物，深入证实表观调控因子TrxG家族调控肝脏KCs分化及功能活化的组蛋白重塑机制及其在慢性肝病恶性转化病理过程中的关键生物学作用；探讨TrxG调控肝脏KCs表型和炎症因子转录的组蛋白甲基化共价修饰等表观遗传学机制；鉴定TrxG及TLR4/IL-6促炎信号通路间的相互调控机制及正反馈环路。这将有助于从染色质组蛋白重建角度深入揭示控制肝炎非可控性恶性转化的分子机制。

巨噬细胞是肿瘤微环境中数量最多的免疫细胞，其调控肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答和免疫逃逸，其调控机制有待深入研究。本项目提出科学假设：Men1基因在巨噬细胞中具有潜在的调控肿瘤恶性表型的生物学功能，通过研究解决了如下科学问题：.1..巨噬细胞特异性Men1敲除小鼠模型建立及敲除效果验证。.通过品系间杂交获得巨噬细胞特异性Men1敲除小鼠模型。体外分离小鼠腹腔巨噬细胞（无菌性炎症模型），并通过逆转录PCR(RT-PCR)、Western-blotting及免疫荧光检测IF验证了巨噬细胞特异性Men1基因敲除效果。.2..DEN诱导肿瘤模型建立及肿瘤表型分析。.腹腔注射DEN建立小鼠原发性肺癌和肝细胞肝癌疾病模型，并通过Micro-CT和Micro-MRI影像学检查明确了巨噬细胞Men1敲除促进肿瘤的早期进程；小鼠处死收取样品，通过大体表型统计及病理学检测进一步证实巨噬细胞Men1敲除促进肿瘤的恶性表型。.3..巨噬细胞Men1敲除促进肿瘤恶性表型的机制探索。.利用巨噬细胞特异性MLL敲除小鼠建立DEN诱导肿瘤模型，进而鉴定了巨噬细胞Men1敲除促进肿瘤恶性表型不依赖于MLL；HE及免疫组织化学结果揭示:Men1敲除促进肿瘤膨胀性生长，抑制肿瘤内部成纤维细胞（α-SMA）、巨噬细胞(F4/80)和CD8+T细胞(CD8)的浸润；RNA-seq和ChIP-seq鉴定了巨噬细胞中Men1的下游靶基因调控网络。.4..临床肿瘤患者外周血MEN1基因点突变检测。.收集临床肺癌患者（40例）、肝细胞肝癌患者（166例）及正常对照组（199例）外周血，MEN1 c. 1784 C >T 点突变检测发现肝细胞肝癌患者突变率为89%、正常对照组为1%、肺癌患者为0。提示，外周血MEN1 c. 1784 C >T作为肝细胞肝癌病人风险因素的潜在可行性。.本项目证明了巨噬细胞Men1敲除促进肿瘤恶性表型生物学功能和病理学基础；鉴定了巨噬细胞中Men1的下游靶基因调控网络，探索了Men1独立于MLL调控肿瘤恶性表型分子机制；探讨了MEN1 c. 1784 C >T 点突变作为肝细胞肝癌风险因素、不良预后和免疫治疗疗效预测标志物的潜在可行性。