西瓜果实有色体蛋白糖基化修饰调控瓤色形成的分子机制

Flesh color of watermelon (Citrullus lanatus) is an agronomically important trait that is predominantly determined by a network of the carotenoid biosynthetic pathway. Here, we first through map-based cloning and GWAS analysis characterized the flesh controlling gene-lycopene β-cyclase (ClLCYB), which located in chromoplast. There are two SNPs which lead to two amino acid substitution (V223F and K435N) between the two parents, but both the two ClLCYB alleles constructs can convert lycopene to downstream products. With data analysis, N435 is putative asparagine residue to be N-glycosylation in ClLCYB protein. The different molecular weights of these two ClLCYB proteins were shown in Western blot. Different clues showed that there may be different protein glycosylation in these two ClLCYB proteins. To test this hypothesis, we plan to use bio-MS to analysis the protein profiles during the chromoplast development in different flesh color lines. And use protein N-glycosylation analysis, fruit protoplast transformation, tobacco leaf transformation system to analysis protein glycosylation, location, stability of these two ClLCYB proteins. CRIPSR-Cas9 and overexpression of ClLCYB will be constructed to verify their biological function in chromoplast development. Our research will provide new insights into understanding the important protein post-translation modification in watermelon chromoplast development and gives a new theoretical basis for watermelon.

果实瓤色是决定园艺作物营养与商品价值的重要经济性状。前期通过图位克隆与GWAS分析，确定了控制西瓜瓤色（红/黄白）基因—有色体茄红素环化酶基因ClLCYB，并发现223位及435位氨基酸的变化，而体外实验发现这并未导致蛋白催化功能的改变。进一步研究发现435位氨基酸是一个可能的糖基化位点，且Western检测发现不同瓤色中该蛋白大小有差异。因此，我们假设：ClLCYB蛋白翻译后修饰导致西瓜瓤色变异。本项研究拟采用有色体蛋白质组质谱高通量分析技术，系统比较红瓤与黄白瓤西瓜有色体蛋白表达谱差异；利用蛋白糖基化分析、果肉原生质定位与烟草瞬时表达技术确定ClLCYB蛋白的糖基化修饰，明确不同修饰状态的蛋白在定位、丰度或稳定性上的变化；采用CRISPR编辑技术定点突变该基因，明确位点突变对西瓜类胡萝卜素代谢途径的影响。本研究首次从蛋白质修饰水平揭示西瓜瓤色形成的分子机制，丰富西瓜分子育种的理论基础。

果实瓤色是决定园艺作物营养与商品价值的重要经济性状之一。西瓜具有葫芦科作物中最鲜艳的瓤色。为了揭示西瓜瓤色形成的生理基础及分子机制，项目通过图位克隆、基因功能验证及蛋白分析等方法，发现西瓜有色体重要的番茄红素环化酶基因ClLCYB在蛋白水平的变化是西瓜红瓤产生的原因。项目前期已经明确西瓜瓤色是由果瓤细胞中的有色体不断发育并大量积累类胡萝卜素类物质形成的，而其中的关键基因ClLCYB蛋白在野生到栽培种的驯化中发生了编码氨基酸的变化。项目首先通过对红瓤控制位点的精细定位及西瓜属全部7个种的 221份代表性瓤色资源的序列分析，发现了西瓜番茄红素环化酶ClLCYB是西瓜红瓤控制基因。研究发现该基因中两个引起氨基酸变化的位点与红瓤表型紧密连锁，并根据基因序列分析揭示了红瓤西瓜品种与其他瓤色品种不同且相对保守和独立的驯化过程。基因定位及催化功能研究表明：不同瓤色西瓜中该基因编码蛋白均定位在果实细胞有色体中；都具有将番茄红素催化为β胡萝卜素的能力，且催化活性差异不大。研究还发现该基因在不同瓤色西瓜品种、果实不同的发育时期的转化水平变化不显著。最终通过对该基因蛋白水平的检测，发现该ClLCYB蛋白积累水平与番茄红素的积累呈现负相关性。研究表明不同瓤色西瓜中该蛋白中两个氨基酸酸的替换引起了该蛋白稳定性的差异，从而导致了其底物番茄红素的积累产生了红瓤西瓜。研究阐明了西瓜红瓤基因的作用机制及其在瓤色驯化中的重要作用，也为转录后翻译及蛋白水平调控果肉细胞有色体发育以及瓤色发育的提供了重要的研究证据。本研究首次从蛋白质修饰水平揭示西瓜瓤色形成的分子机制，丰富西瓜分子育种理论基础。同时，成功将该红瓤基因的分子标记服务于特色瓤色西瓜育种实践，培育出具有红、血橙、橙、黄、白等瓤色的“京彩”系列西瓜新品种。