应用水稻悬浮细胞研究南方水稻黑条矮缩病毒的复制机制

Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV), which is transmitted by the white-backed planthopper in a persistent-propagative manner, has spread rapidly throughout southern China and can severely damage rice. To further investigate the functional roles of viral proteins in host plants, here we used rice cell suspension culture and rice protoplast system. Analysing expression level of viral proteins and identifing viral proteins taking part in the replication cycle in host plants are required. Furthermore, by interference with the expression of a protein in the transgenic rice cell suspension culture and transgenic rice protoplast, we can further confirm proteins critical for viral replication. Meanwhile, rice plants resistent to SRBSDV could be obtained. Our study would advance the understanding of the biological activities of viral proteins in host plants, and provide theory evidence for disease control.

南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）是这几年影响我国南部水稻种植的主要病害，由白背飞虱持久增殖型方式传播。针对SRBSDV与寄主植物互作和致病机理尚不清楚的问题，本项目应用水稻悬浮细胞和原生质体细胞培养技术，解析病毒编码的蛋白在寄主细胞中的表达情况，鉴定与病毒复制相关的关键因子。应用RNAi体系对水稻进行遗传转化，获得可引起基因沉默的水稻悬浮细胞和原生质体细胞，进一步确认病毒复制关键基因，同时获得高抗病能力的水稻品系。本研究为阐明SRBSDV在寄主水稻内的致病机理提供理论基础，为病害的有效控制提供理论依据。

针对水稻病毒与寄主植物互作和致病机制尚不清楚的问题，本项目应用水稻原生质体细胞培养技术，解析了病毒编码的部分蛋白在水稻细胞中的表达情况。.首先通过Gateway系统进行原核表达，免疫兔子制备了8个抗体。分别为：南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）结构蛋白P10和非结构蛋白P9-1，水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）主要外壳蛋白P8和3个非结构蛋白（Pns6、Pns7和Pns10），水稻矮缩病毒（RDV）结构蛋白P8和非结构蛋白Pns6。间接ELISA测定其效价分别为1：6400和1：3200，1：2500、1：2000、1：2500和1：3000，1：6400和1：6400。Western blot检测结果表明8个抗体均可特异性检测感病毒株，并且均可应用于田间病毒的检测。.其次利用PEG介导病毒侵染原生质体的侵染体系，并结合免疫荧光技术、实时荧光定量PCR技术以及Western blot技术等对病毒各基因在水稻原生质体中的复制和表达进行了分析。1）免疫荧光技术检测结果显示，SRBSDV、RRSV和RDV均可成功侵染水稻原生质体；2）实时荧光定量PCR检测结果显示，SRBSDV的S5-1、S5-2、S6、S7-2、S9-1以及S9-2基因在病毒侵染原生质体后36h左右表达达到高峰，S7-1以及S10基因在48h左右表达达到高峰；RRSV的S6、S7以及S10基因在病毒侵染原生质体后24 h左右表达达到高峰，S8基因在32 h左右表达达到高峰；RDV的S6和S12基因在病毒侵染原生质体后24 h时表达达到高峰，S8、S10以及S11基因在36 h时表达达到高峰。所有基因的表达动态都维持一个先上升再下降的趋势。3）Western blot检测结果显示，SRBSDV的P5-1、P6以及P9-1蛋白在病毒侵染原生质体后48 h左右表达达到高峰，P7-1及P10蛋白在60 h左右表达达到高峰；RRSV的Pns7蛋白在病毒侵染原生质体后32 h左右表达达到高峰，Pns10蛋白在60 h表达达到高峰，P8蛋白在48 h左右达到高峰；RDV的P8蛋白在病毒侵染原生质体后36 h左右表达达到高峰，Pns6蛋白在24 h左右表达达到高峰。病毒蛋白的表达维持一个非结构蛋白先于外壳蛋白表达的趋势。.本项目结果将为理解水稻病毒在寄主水稻内的复制机制提供理论基础，为病害的有效控制提供理论依据。