人胚肝前体细胞分化过程中Claudins蛋白表达与肝细胞极性建立的研究

紧密连接是维持肝细胞极性的关键结构，是肝细胞执行功能的结构基础和保证。Claudins蛋白是组成紧密连接的关键分子。探究Claudins蛋白在肝前体细胞分化过程中的表达调控,可以从一个侧面阐明肝前体细胞的分化机制。肝前体细胞的分化是由细胞内转录因子与多种细胞外信号分子精确、严密调控肝特异性基因量序表达的过程。我们推测并初步证实，调控肝前体细胞分化的因子同时调节Claudins 蛋白的表达,Claudins蛋白的表达与肝细胞极性的建立密切相关。本课题拟通过建立体外人胚肝前体细胞分化为肝细胞的有效程序，测定在不同因子及细胞外基质的作用下，肝前体细胞表达不同Claudins的时间、细胞内空间的变化，明确调控其表达的关键因子,分析调控Claudins蛋白表达的信号机制；通过克隆肝特异性Claudins基因、设计siRNA，研究过表达及低表达Claudins对肝前体细胞分化过程中细胞极性建立的影响。

紧密连接是维持肝实质细胞极性的关键结构，是肝细胞执行功能的结构基础和保证。Claudins蛋白是组成紧密连接复合体的关键分子。探究claudins蛋白在肝前体细胞分化发育过程中的表达调控，可以从一个侧面阐明肝前体细胞的分化机制。本课题拟通过建立体外人胚肝前体细胞（hFHPCs）分化为具有成熟功能的、极性肝实质细胞的有效程序，并研究肝实质细胞成熟过程中，claudins蛋白表达与肝实质细胞极性建立的相互关系。通过分析不同细胞外信号分子，细胞外基质单独或联合处理对hFHPCs分化诱导作用，本研究成功建立了体外定向诱导hFHPCs向成熟肝实质细胞（HLCs）方向分化的两阶段诱导程序；通过对诱导后所获得的HLCs进行mRNA水平、蛋白水平、细胞形态、合成及分泌功能等特征鉴定后证实：HLCs具有正常人体肝实质细胞的典型特征，即HLCs中甲胎蛋白蛋白表达降低，白蛋白表达增加，细胞角蛋白8表达增加，可见双核细胞，同时α-抗胰蛋白酶呈阳性表达；具有分泌白蛋白、代谢氨合成尿素、较强的糖原合成能力和细胞色素P450酶活性。更为重要的是，HLCs具有肝细胞的极性特征，即肝细胞顶、底侧面特征性蛋白的定位表达、相邻细胞间紧密连接的形成、、胆小管样结构的形成、胆汁分泌功能获得等。利用Microarray技术以及实时定量PCR分析显示：hFHPCs表达claudins家族的1，2，4，9，10，11，12， 14，15，19及22；其中claudin 1在肝实质细胞成熟过程中的变化最为明显，呈现出先升高，后下降的规律；利用siRNA干扰技术将前体细胞中claudin 1的水平降低后研究分析，细胞内claudin 1水平下降是触发其向膜上定位、并形成紧密连接的关键因素；进一步研究发现，在HLCs极性形成过程中，转录抑制因子SLUG对于claudin 1的表达起主要的抑制作用；而诱导HLCs成熟的因子OSM及DEX可能通过MAPK及JAK-STAT信号途径下调claudin 1的表达。通过对HLCs极性形成过程中差异基因表达的深度挖掘，我们筛选出一组调节与维持肝实质细胞极性密切相关的基因，并预测这些关键分子间的相互关系。本研究为阐明肝实质细胞极性形成的分子机制特性提供了很好的理论及实验基础。