人脂肪间充质干细胞定向肝实质细胞分化的研究

人脂肪间充质干细胞（hAT-MSCs）是近年来备受关注的成体干细胞，因其具有多向分化潜能而有希望成为治疗肝损伤的靶细胞。但目前尚不明确hAT-MSCs向肝实质细胞（HCs）定向分化的机制。阐明这一机制，将为hAT-MSC治疗肝损伤提供一定的实验依据和理论基础。干细胞分化受细胞内转录因子与细胞外信号分子的精确调控。我们前期工作发现，人肝前体细胞向HCs分化的调节呈明显的阶段性，据此我们假设"hAT-MSCs向HCs定向分化需先分化为腹侧前肠特定内胚层前体细胞(EPCs)，继而为肝脏前体细胞"。本课题拟通过体外分离培养hAT-MSCs，流式细胞测定细胞表面抗原，采用不同因子组合对hAT-MSCs进行分阶段诱导，RT-PCR，免疫细胞化学等方法鉴定不同分化阶段细胞的特征，明确hAT-MSCs向HCs定向分化的阶段性特点。利用特异性抑制剂、siRNA研究hAT-MSCs向EPCs分化的信号机制。

近年来的研究表明，基于丰富来源、易获得等优点，人脂肪干细胞（hASCs）成为治疗肝脏疾病最具吸引力的成体干细胞。而明确hASCs定向肝实质细胞分化的机制是hASCs用于肝脏疾病治疗的关键。.本项目拟通过体外分离、筛选同质性的hASCs群体、分析其细胞表型、转录因子表达及多向分化潜能等特征；分析其定向肝实质细胞分化的机制；探讨体外定向诱导hASCs获得的肝实质样细胞（HLCs）对于急性肝脏损伤的修复能力。.研究结果如下：1.分离、优化培养基筛选出同质性的hASCs。2.确定同质性hASCs的特征：高表达CD90、CD73和CD105抗原；表达多潜能因子NANOG，OCT4，SOX2和SALL4；具有定向脂肪、骨骼和软骨分化的多向分化潜能特性。3.建立了三阶段、多因子依次定向诱导hASCs向HLCs分化的程序。4.明确了hASC-HLCs的形态结构、特征性蛋白表达等特点，如具有细胞极性，表达ALB、CK8、HNF4α等蛋白，具有白蛋白分泌，糖原贮存，代谢氨，CYP450活性及胆汁分泌等功能特征。5.明确hASCs定向EPCs分化的作用机制。高浓度Activin A通过磷酸化smad-2/3，Wnt3a及GSK3抑制剂可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路，上调内胚层前体细胞中转录因子HHEX，GATA4，FOXA2和SOX17的表达，但二种信号通路间无明显的协同作用。6.确定hASC-HLCs在去细胞人羊膜基质（AHAM）上可组装形成类肝脏组织样三维结构。将该体系移植到CCl4诱发的急性肝脏损伤裸鼠肝脏内，可明显降低宿主肝脏组织的损伤程度，并可与宿主肝脏完全整合，能维持HLCs特征性蛋白人核抗原、ALB、HNF4α表达。移植8周后，移植物区域出现类血管样结构，在宿主尿液中可检测出人肝实质细胞的代谢产物，说明hASC-HLCs具有肝实质细胞的代谢功能。.本研究表明，定向诱导hASCs可获得具有典型形态特征、成熟功能以及体内修复肝脏损伤的HLCs。这一研究为hASCs真正进入临床治疗、进一步探讨hASCs定向分化机制以及研究病毒感染机制、肝脏代谢性疾病、肝脏特异性药物筛选等，提供重要的理论依据和实验基础。