拟南芥类突出结合蛋白SYT2在铜胁迫反应中的解毒机制

Higher plants have evolved complex and elaborate mechanism to resist different environmental stresses. Copper (Cu) is one of essential elements for plant growth and development, however excess copper is detrimental to plants. Recent years there have been great advances about mechanism of response to copper stress in plants, but mechanism of copper secretion has been rarely reported at cellular and molecular levels.Synaptotagmin (SYT)is considered as "Ca sensor" and has a vital role in endocytosis and exocytosis in animal cells.Based on the disadvantages of previous results, this project will use synaptotagmin-like protein (SYT2) in Arabidopsis to carry out the following three aspects of study: 1) To observe phenotype of SYT2 knock-out mutant in response to copper stress and to verify SYT2 is involved in copper secretion through yeast functional complementation experiments; 2) To study subcelluar localization of copper and copper transport ability of SYT2; 3)to study relationship between copper accumulation and calcium distribution/calcium flux in wild type and mutant seedlings.Several new methods and techonologies, including Spinning Disk Laser Scan Confocal Microscope and in vivo labeling of copper etc.,will be used to clarify the function mode of SYT2 in copper detoxicity in plants and provide theoretical foundation for application of copper pollution areas.

高等植物在长期的进化过程中形成了复杂而精细的抗性反应机制以抵抗各种环境胁迫。铜(Cu)是植物生长发育所必需的营养元素,但过量的铜会对植物产生毒害作用。近年来关于植物铜胁迫的响应机制的研究取得了不少成果，但从分子细胞水平上探讨细胞内铜分泌机制的研究尚不多见。突触结合蛋白（SYT）作为"Ca sensor"在动物细胞的胞吞胞吐过程中发挥重要功能。本项目针对前人研究的不足，拟以拟南芥类突触结合蛋白SYT2为研究对象，着重开展以下几方面的研究： 1）观察铜胁迫下SYT2缺失突变体的表型，并用酵母功能互补实验证明SYT2与铜分泌有关；2） 研究细胞内铜离子的亚细胞定位及SYT2对铜转运能力的影响；3）研究铜累积与钙分布和钙离子流的关系。在上述研究中拟采用多种新方法和新技术，包括转盘式激光共聚焦显微镜技术和铜离子活体标记技术，阐明SYT2在铜解毒过程中的作用模式，为铜污染土壤的利用提供科学依据。

铜(Cu)是植物生长发育必需的营养元素之一,但当环境中的铜过量时也会对植物产生毒害作用。高等植物在长期的进化过程中形成了复杂而精细的Cu积累，转运和贮存机制，进而维持Cu稳态平衡。本项目对非经典分泌途径相关蛋白SYT2的亚细胞定位和组织表达模式及其对Cu的吸收和积累的影响进行研究。结果表明，SYT2定位于高尔基体，在维管束和花粉粒中表达最高。正常条件下其缺失突变体中Cu吸收相关基因表达上调，表现为缺铜表型。而在Cu缺乏条件下，WT植株中这些Cu转运蛋白基因COPT1,COPT2 和ZIP2等的表达均明显上调，但在syt2突变体中，则只有COPT2显著上调，说明SYT2的缺失显著改变了植物对Cu水平的响应模式。由于Cu吸收相关蛋白COPT1缺乏信号肽，且定位模式对BFA处理不敏感，因而推测其质膜定位可能是通过非经典分泌途径完成的。在syt2突变体中我们发现COPT1-GFP大量存在于胞内小液泡和中央大液泡内。Cu处理后WT植株中COPT1-GFP的稳定性降低，说明Cu处理可以诱导COPT1-GFP发生降解。而在syt2植株中，Cu处理后COPT1-GFP的降解被抑制。我们的结果表明SYT2对COPT1的分泌及其蛋白周转过程均发挥重要作用。这些结果为揭示Cu稳态平衡机制提供证据，同时也为培育适用于Cu污染土壤植物修复的工程植株提供思路。