具漆酶活性的芽孢蛋白CotA基因的异源分泌表达及处理废水的初步研究

漆酶的底物范围十分广泛，可有效降解木素、染料及酚类等多种化合物，在生物制浆、纸浆漂白及造纸废液处理等领域具有重要应用价值。真菌漆酶已商品化生产，但其稳定性较差，在碱性、高温等环境中易失活。细菌芽孢漆酶(芽孢外壁蛋白)具有耐高温、耐碱等优点，备受人们瞩目。但细菌芽孢产量低，漆酶为芽孢外壁蛋白，呈不溶状态，难以分离纯化，限制了细菌芽孢漆酶的应用。申请者已分离到多株漆酶活性高的芽孢杆菌，并已克隆出芽孢漆酶基因。本项目拟通过构建共表达或融合表达重组载体，实现芽孢漆酶基因在大肠杆菌的重组胞外分泌表达；通过盐析、离子交换层析和凝胶层析纯化出重组细菌漆酶，并研究重组漆酶的酶学性质。为后续利用大肠杆菌繁殖快、发酵工艺成熟的优点，大幅度提高细菌漆酶产量，实现细菌漆酶产业化生产奠定基础。优化纯化的细菌漆酶对木素和染料的降解条件，筛选出适合于重组细菌漆酶的介体系统，并初步进行造纸和染料废水处理研究。

CotA漆酶位于芽孢外壁，具有耐高温、耐盐碱等优良的酶学特性，其催化底物广泛，是极具应用潜力的环保酶制剂。但CotA蛋白附着于细菌芽孢上的不溶解特性，限制了其应用。本研究采用了两种分泌表达系统实现CotA漆酶在大肠杆菌的胞外表达。结果显示在微好氧条件下由α溶血素分泌系统介导的表达菌株漆酶分泌率最高，达到78.75%。骨架载体会影响重组CotA漆酶的分泌率，这与表达载体上的相关元件差异有关。利用YebF分泌元件融合CotA漆酶基因构建的表达菌株在微好氧条件下没有胞外漆酶活性。而该重组菌株在自诱导培养条件下能够分泌表达CotA漆酶，代表不同的分泌系统所需的诱导条件也各异。而不含有任何表达元件介导CotA漆酶胞内表达的PSD菌株在微好氧培养条件下能够“胞外”表达CotA漆酶，且其胞外漆酶分泌量显著高于其他工程菌株。 对PSD菌株分泌表达CotA漆酶的诱导条件进行了优化，发现诱导温度和硫酸铜浓度是影响目的蛋白表达的主要条件。当摇动温度为25℃，微好氧培养温度为30℃时，胞外CotA漆酶的活性达到最高值（167.2 U/L）。大肠杆菌在对数生长期时开始诱导有利于胞外漆酶的表达。利用亲和层析技术成功实现了重组CotA漆酶的一步纯化。质谱结果显示目的蛋白与枯草芽孢杆菌Spore coat protein A最为接近。重组CotA漆酶具有较高的热稳定性，并且在中性和碱性条件下有极强的稳定性，其他酶学特征与野生型芽孢漆酶相类似。本研究还对PSD菌株“分泌表达”CotA漆酶的原因进行了探索。发现铜离子是引起PSD菌株表达CotA漆酶的重要因素，向培养基中添加一定量的硫酸铜会改变大肠杆菌的渗透势，CotA漆酶可能是通过这个原因“渗透”到细胞外的。同时，本研究还考察了产CotA漆酶的表达菌株的自诱导培养，发现PSD菌株在好氧条件下依然能够胞外表达CotA漆酶。并且共表达分子伴侣能够显著提高PSD菌株胞外表达漆酶的表达量。同时通过对YSD菌株的自诱导培养在培养基中成功检测到了漆酶活性。证实YSD菌株也可以胞外表达CotA漆酶。重组CotA漆酶对偶氮、蒽醌、靛青、芳甲烷类单染料均显示出良好的脱色效果，此外还研究了CotA漆酶对工业模拟染料废水的脱色情况，未经条件优化的脱色反应系统48 h 后对模拟染料废水的脱色率达到68.06%，显示了其耐受极端条件的优异酶学特性及较高的染料脱色能力。