重组人血清对氧磷酶1（rhPON1）基因亚型同工酶在防治有机磷中毒作用的研究

The morbidity of organophosphorus posioning(OP) is high, while the drug, now could be used, can only play a symptomatic effect, but cannot remove the posion from body completely. Paraoxonase-1 (PON1), as the biological scavenger, can hydrolyz the organophosphorus before they affect the target organ and has become the research hotspots. The applicant had expressed successfully the recombinant human PON1 isozyme (PON1Q192 and PON1K192) from the prokaryotic cells and test their effect on preventing and treatment of organophosphorus poisoning . But we have found that the product and activity of them were lower than the natural PON1.Therefore, we consider elevating the product and activity of PON1R192 and PON1Q192 subtype-gene isozyme expressed from eukaryotic cell by using biological reactor and resolving the problem of prokaryotic cells in laking protein modification after gene translation and the formation of inclusion body. Meanwhile, we want to test the effect of glycoprotein on influencing the activity of PON1. Then we will observe the substrate dependant of PON1 on different organophosphorus and compare the effect of different PON1 isozyme in prevention and treat different organophosphorus poisoning to select the PON1 isozyme with higher activity to hydrolyze specific organophosphorus.

有机磷中毒死亡率高，而现有的治疗药物只能起到对症治疗的作用，并不能真正消除其毒性。对氧磷酶1（PON1）作为生物清除剂能够在有机磷到达靶器官之前将其有效的水解，因而成为目前研究的热点。申请者在前期研究中成功从原核生物细胞中表达出重组PON1Q192和PON1K192亚型，并验证了其对有机磷中毒的防治作用。但与天然PON1相比，其产量和活性均相对较低。因此，本研究拟借助于生物反应器，通过真核生物细胞大量表达重组PON1R192和PON1Q192基因亚型同工酶，解决前期研究中发现的原核细胞表达系缺乏目的基因翻译后修饰和表达蛋白形成包涵体的问题，提高PON1的稳定性和产量。同时研究PON1的分子中糖蛋白链对其活性的影响。在此基础上，将PON1的不同基因亚型施加给不同类型有机磷毒剂染毒的大鼠，观察它们对有机磷解毒效果的底物依赖性，比较它们对有机磷中毒的预防和治疗作用，以选择出高活性的有机磷水解酶。

有机磷类杀虫剂是农业生产中一种常见的农资，在世界范围内的农业生产中被广泛的应用。但是在与有机磷相关的生产、运输和应用中，由于意外沾染和不当使用会造成急慢性中毒。目前临床使用的常规治疗方法是应用阿托品和解磷定控制中毒后产生的毒蕈碱样和烟碱样症状。最近研究发现，对氧磷酶（paraoxonase，PON1）是人体内天然存在的一种磷酸酯酶类，可以对体内外多种有机磷化合物进行高效、无毒的水解作用。本课题研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达体系，通过基因重组的方法，大量表达和获取活性强、产量高的不同PON1 R/Q192单基因亚型同工酶，并对其进行脱糖基化等相关研究，探索翻译后修饰对于PON 1活性的影响。同时，对于不同基因亚型的PON 1的解毒作用的分子学机制进行更有区别性的和针对性深入研究。为应用PON1防治有机磷中毒提供理论和实验依据。. 在实验中，通过昆虫杆状病毒蛋白表达体系可以大量表达生成高活性的rhPON1 R/Q192同工酶。脱糖基化前，rhPON1 R/Q192和天然的hPON1表现出一致的底物特异性。脱糖基化后，重组型和天然型的对氧磷酶的分子量出现了一致性的下降，底物的特异性消失。rhPON1 R192 和 rhPON1 Q192 对于不同的有机磷底物，其水解活性是不同的，R 型和 Q 型对于不同底物表现出的活性高低完全相反，这和之前研究发现的 hPON1 的基因多态性一致。对rhPON1 R/Q192预处理组和染毒组大鼠进行观察比较发现，与染毒组相比，预处理组大鼠临床表现更好，各脏器组织损伤情况均有明显改善。 这一研究成果进一步拓宽了急性有机磷化合物中毒防治的路径，对临床医学、农业生产生活防护和反化学战及恐怖袭击均有重要的应用价值。