重组人类对氧磷酶192K亚型的构建及对有机磷中毒解毒作用研究

有机磷中毒死亡率高，致残率也高。现有的有机磷拮抗剂只能起对症作用，不能真正消除有机磷毒作用。对氧磷酶-1（PON1）是目前国际上研究能够拮抗有机磷的生物清除剂的热点。申请者在以前的研究中成功从E.Coli上表达出重组人PON1Q192亚型，并验证了其对有机磷中毒有保护作用。但与天然PON1比较其催化效能相对低，体内半衰期相对短。目前发现192位点是影响酶活性的关键位点，而兔PON1活性最高，且192位点为赖氨酸（K）。因此，本研究拟通过定向诱变技术设计出重组PON1K192提高其催化效能，并通过聚乙二醇化学修饰（PEG-rPON1K192）延长体内半衰期，同时投于健康动物体内观察PEG-rPON1K192药动学变化。在此基础上，将其投于有机磷中毒大鼠，观察对有机磷代谢的影响，并分别或联合应用PEG- rPON1K192、阿托品、氯解磷定，比较它们对有机磷中毒的治疗作用。

有机磷农药是常见的一类有机磷酸酯类化合物，应用广泛。在农业生产生活、战争和恐怖袭击事件及自杀事件中易造成急性中毒。以往治疗有机磷中毒的方法主要是应用阿托品和解磷定控制中毒后产生的毒蕈碱样和烟碱样症状。近年来研究发现，对氧磷酶（paraoxonase，PON1）能够水解多种有机磷化合物，其重组蛋白成功进行了动物实验，证实其增加了大鼠对有机磷的耐受性。研究表明，PON1氨基酸序列中的192位点是酶活性的关键位点。本实验研究通过基因重组的方法，对PON1基因192位点进行定向诱变，使其编码赖氨酸（K192），并通过大肠杆菌表达系统获得重组PON1K192（rHuPON1K192），经纯化后对其催化水解有机磷化合物的活性进行测定，并应用于有机磷染毒大鼠，观察其对神经系统、肝脏、肺和心肌的保护作用，探讨PON1抗有机磷中毒的作用机制，为应用PON1防治有机磷中毒提供理论和实验依据。. 在实验中，将含有目标核酸序列的pCold II-rHuPON1K192阳性表达载体在大肠杆菌系统成功表达，提纯获得具有一定活性蛋白经过聚乙二醇化学修饰并应用于动物实验。对rHuPON1K192预处理组和有机磷农药毒死蜱染毒组大鼠的临床表现、脏器损伤血清学标记物水平、光镜与电镜下组织细胞损伤情况进行观察。与染毒组相比rHuPON1K192预处理组大鼠临床表现好于染毒组，各脏器组织损伤情况均有明显改善。证实rHuPON1K192对有机磷中毒大鼠中枢神经系统、肝脏、肺和和心肌具有保护作用。这一研究成果进一步拓宽了急性有机磷化合物中毒防治的路径，对临床医学、农业生产生活防护和反化学战及恐怖袭击均有重要的应用价值。