发展新型荧光方法在血浆中原位探测转甲状腺素蛋白的早期错误折叠态

Transthyretin that secrets from human cells into blood plasma can misfold, aggregate, and deposit across different tissues, leading to familial amyloid polyneuropathy and senile amyloid cardiomyopathy. Accurate detection of the early-stage misfolded transthyretin in blood plasma is essential for early diagnosis of these diseases and our understanding of pathogenic mechanisms. Current fluorescence-based methods to detect misfolded proteins in blood plasma utilize either conformation specific antibodies or fluorescent dyes, neither of which can probe misfolded transthyretin effectively. Towards this goal, we propose to develop a novel strategy using transthyretin-fluorophore conjugate as a fluorogenic probe to detect misfolded transthyretin in blood plasma. Introduction of recombinant transthyretin improves selectivity of the conjugate probe, as it will bind to other misfolded transthyretin originally in blood plasma. Meanwhile, de novo designed environment-sensitive fluorophores enhance the sensitivity of the conjugate probe towards misfolded species. Success of such a fluorogenic method will provide mechanistic insight of senile amyloid cardiomyopathy caused by the misfolding and aggregation of transthyretin. Our initial results support the feasibility of this proposal.

转甲状腺素蛋白（TTR）从人体细胞分泌至血浆中会发生错误折叠、聚集和沉淀，进而引起家族型淀粉样多发性神经病和老年型心肌病。TTR错误折叠状态的检测对疾病的早期诊断和机理研究十分重要。现有荧光检测方法无法有效地检测血浆中TTR的早期错误折叠态，导致此类疾病的致病机理不清晰。本项目采用重组TTR与荧光基团偶联的共轭大分子作为新型探针解决上述技术问题。新方法利用重组TTR作为探针的一部分，保证了探针在血浆中有选择性地结合错误折叠的TTR。此外，与TTR偶联的新型环境敏感荧光分子在TTR错误折叠时发出强烈荧光。二者联用作为探针可以实现血浆中TTR早期错误折叠态的荧光检测。此项目的成功将为阐释TTR早期错误折叠态的致病机制奠定技术基础。初始数据已经证明了此项目的可行性。

转甲状腺素蛋白（TTR）的错误折叠、聚集和沉淀，引发家族型淀粉样多发性神经病和老年型心肌病。然而，作为该疾病的早期生物标志物，TTR早期错误折叠的寡聚体难以捕捉并检测。现有临床检测技术无法实现该疾病的早期诊断。本项目围绕“发展新型荧光方法在血浆中原位探测转甲状腺素蛋白的早期错误折叠态”这一研究目标，凝练“荧光分子对蛋白质聚集状态敏感度的化学调控规律”这个科学问题，发展了多种对蛋白质不同聚集状态敏感的荧光探针分子，结合化学生物学生物正交蛋白质-荧光小分子偶联技术，实现对TTR蛋白聚集全过程的实时监控，并揭示其与其他致病蛋白共聚集过程的机制。此外，通过引入对正确折叠态TTR的标记探针和色谱荧光定量，实现患者血浆中错误折叠态的反向定量。项目实施期间，课题组从（1）荧光探针的衍生与合成、（2）蛋白质纯化和生物正交标记方法、（3）聚集机制机理研究以及（4）患者血样测试等四个方面递进式开展研究工作，取得了阶段性的成果和产出，按计划完成了前期提出的研究目标。..项目实施和执行期间，以该基金编号标注名义，共发表学术论文18篇，其中包括国内、外重要学术刊物如Aggregate（1篇），Angew. Chem. Int. Ed.（4篇），Anal. Chem.（3篇），Chem. Sci. (1篇), ACS Sensors（1篇）,Amyloid（1篇）等。培养博士生（在读）5名，硕士生（在读）3名，博士后出站1人，并晋升助理研究员。该项目所搭建的血浆检测方法，申请发明专利3项，与上海交通大学附属仁济医院心内科、北京大学附属第一医院神经内科等医院合作，验证了该检测方法的临床可行性。所开发的技术与医疗器械公司合作积极报批第二类体外诊断试剂注册。课题组与辉瑞制药公司签订两项技术开发合同，推动该技术在临床的推广和应用。