HERG通道功能调控的新机制-SUMO化修饰及其位点的确定

HERG (human ether-a go-go-related gene) channel is highly expressed in the heart, encoding the IKr potassium channel for the rapid repolarization of the cardiac action potential. HERG channel block induces long QT syndrome (LQTs), and futher causes fatal arrhythmia and sudden cardiac death. The most common adverse effects of arsenic trioxide (ATO) in clinical treatment are LQTs. We have previously demonstrated use of ATO at clinically relevant concentrations triggers SUMOylation in cardiomyocytes. The previous studies have demonstrated that post-translational modification of HERG channel effects its function. In this study, we predicte the SUMOylation sites of HERG protein for the first time and constructed the different SUMO mutants. The role of SUMOylation sites of HERG protein is determined by molecular biology techniques and whole-cell patch clamp. This study may provide theoretical basis for comprehensively understanding the regulatory mechanism of HERG channel, which is of great significance for the effective prevention and treatment of drug-induced LQTs and sudden cardiac death.

HERG（human ether-a go-go-related gene）通道在心脏中高表达，编码心肌动作电位3期快速复极化电流（IKr）。HERG通道被抑制可诱发长QT综合症(LQTs)，甚至引起致命性心律失常和心源性猝死。三氧化二砷（ATO）在临床应用中最常见的不良反应是LQTs，前期研究中发现，应用临床相关浓度的ATO触发心肌细胞中SUMO化修饰。以往的研究表明蛋白质翻译后修饰影响HERG通道功能，本课题针对预测到的HERG蛋白SUMO化修饰位点，拟突变HERG蛋白的SUMO化修饰位点，构建SUMO修饰位点突变体；利用分子生物学实验和膜片钳技术，首次揭示SUMO化修饰对HERG通道的调控作用，确定HERG通道的SUMO化修饰位点及其功能；为全方位理解HERG通道的调控机制提供全新的理论依据，对有效防治药源性LQTs和心源性猝死具有重要意义。

研究背景：心律失常是一种常见的心血管疾病，与多种并发症相关，甚至引起心源性猝死。因此，揭示心律失常发生和发展机制，寻找新的治疗手段已成为亟待解决的问题。本研究旨在探讨转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）通过促进心肌内向整流钾离子通道蛋白经小泛素样相关修饰(Small ubiquitin-like modifier ，SUMO)蛋白修饰，调控内向整流钾电流（Inward rectifier potassium current，IK1），为心律失常的发病机制和治疗手段带来启示。.方法：分离新生乳鼠心肌细胞进行原代培养，向心肌细胞中加入5 ng/mL的TGF-β1分别处理2 h或24 h后，利用全细胞膜片钳技术检测IK1电流的变化；心肌细胞中加入SUMO蛋白，利用全细胞膜片钳技术检测IK1电流的变化。选择HEK293细胞系，瞬时转染HA-SUMO1/2/3和Flag-Kir2.1质粒，通过免疫荧光实验检测SUMO1/2/3和Kir2.1通道蛋白的细胞定位；采用COS-7细胞系通过邻位连接实验检测SUMO1/2/3蛋白和Kir2.1通道蛋白的结合情况。利用shRNA重组腺病毒敲除心肌细胞内源性UBC9后，采用全细胞膜片钳技术检测TGF-β1因子或SUMO蛋白处理后对IK1电流的影响。.结果：TGF-β1处理2 h能够显著抑制IK1电流，该抑制作用具有时间依赖性；免疫荧光实验显示，Kir2.1通道蛋白与SUMO-1或SUMO-2蛋白在细胞膜上存在共定位作用，但是Kir2.1通道蛋白与SUMO-3不存在相互作用；PLA实验结果证明，TGF-β1处理促进心肌细胞中Kir2.1通道蛋白与SUMO-1或SUMO-2蛋白的结合；膜片钳实验结果证明，SUMO-1或SUMO-2蛋白能够显著抑制IK1电流，SUMO-3不能够抑制IK1电流；敲减UBC9后逆转了此抑制作用；同时，敲减UBC9后逆转了TGF-β1对IK1电流的抑制作用。.结论：心肌细胞Kir2.1通道蛋白可以被SUMO-1或SUMO-2分子修饰，不能被SUMO-3分子修饰；TGF-β1通过促进Kir2.1通道蛋白的SUMO化修饰抑制IK1电流密度。