浮萍LaC3H20调控淀粉代谢的分子机制研究

Duckweed is not only a kind of ideal system for starch accumulation mechanism, but also one of the most potential starch energy plants due to its abilities of fast growth and high efficient starch accumulation. However, the molecular mechanism of high efficient starch accumulation in duckweed remains unclear. Using transcriptome sequencing, a LaC3H20 transcription factor was identified which may be involved in starch metabolism regulation. Then, overexpressing and RNAi duckweed transgenic lines were obtained. The results showed that starch content were decreased in overexpressing lines, while starch content were increased in RNAi lines compared to that in wild-type. Based on these results, our goals are to 1) analyze its temporal and spatial expression patters by qRT-PCR, subcellular localization and in situ hybridization, 2) analyze the structure and morphology of starch and related metabolite during starch metabolism by electron microscopy, HPAECMS/MS, etc. 3) and to further clarify molecular regulation network of LaC3H20 involved in duckweed starch metabolism by transcriptome sequencing, yeast two-hybrid, ChIP/RIP-Seq and EMSA/REMSA. This study will provide theory foundation and technical support by genetic engineering of duckweed and other starch crops to improve starch accumulation.

浮萍具有快速生长和高效积累淀粉的特性，因此它既是一种探讨高效积累淀粉机制的理想研究体系，又是一种极具有潜力的淀粉类能源植物之一。然而，目前浮萍高效积累淀粉的分子机制仍不清晰。我们前期通过对缺氮处理浮萍转录组测序，最终鉴定得到一个可能参与浮萍淀粉代谢调控的LaC3H20转录因子，构建该基因过表达和RNAi载体转化浮萍，结果显示该基因过表达导致浮萍淀粉含量显著下降，抑制该基因表达淀粉含量显著上升。本项目以此为切入点，拟通过qRT-PCR、亚细胞定位和原位杂交等技术分析其时空表达模式；利用电镜和HPAECMS/MS等技术分析转基因株系淀粉及相关代谢物特性；利用酵母双杂交、转录组测序、ChIP/RIP-Seq和EMSA/REMSA等技术深入分析其在浮萍淀粉代谢调控中的生物学功能，鉴定该转录因子调控的下游靶标，解析其在浮萍淀粉代谢过程中的分子调控通路，为未来改良浮萍及其他作物淀粉积累提供理论基础。

浮萍具有快速生长和淀粉高效积累的特性，因而它既是一种极具发展潜力的战略性淀粉类能源植物，又是一种研究植物淀粉高效积累分子机制的理想模式体系。浮萍在逆境胁迫下可以大量积累淀粉，前期研究表明缺氮处理浮萍淀粉积累可以增加3-4倍。然而，目前缺氮胁迫诱导浮萍淀粉高效积累的分子机制仍不清楚。.在缺氮处理的浮萍转录组数据里面找到一个受到缺氮诱导的TZF2转录因子。将该基因构建过表达和RNAi载体转化浮萍并获得转基因植株。在SH培养基中，过表达株系的淀粉含量低于对照，RNAi株系淀粉含量高于对照。与之相反，在缺氮胁迫处理条件下过表达株系淀粉含量显著高于对照，RNAi株系淀粉含量显著低于对照。生长曲线测定结果表明，在生长第21天开始过表达株系淀粉含量高于对照，RNAi株系的淀粉含量低于对照。进一步研究发现该基因在浮萍叶片中的表达量是根的大约30倍，且在叶片组织中广泛分布；另外发现该基因响应缺氮处理，具有转录抑制活性；亚细胞定位结果显示该基因在细胞质中有表达。为了深入解析其参与浮萍缺氮诱导淀粉积累的调控机制，对正常培养（SH培养基）和缺氮处理后的对照、过表达和RNAi株系进行了转录组分析，并对差异表达基因进行qRT-PCR检测，发现多个基因差异表达，其中异淀粉酶2等基因在过表达株系中显著上调。利用Tail-PCR技术克隆异淀粉酶2的启动子区，设计生物素标记探针，EMSA实验结果表明TZF2蛋白能够特异性结合异淀粉酶2启动子区。最后利用拟南芥转录因子文库筛选可能与TZF2相互作用的转录因子，初步获得了多个可能的相互作用蛋白，包括一些ABA信号通路相关的转录因子。.在缺氮处理条件下，TZF2转录因子除了调控淀粉积累还影响了类黄酮合成。实验结果显示在过表达株系中总黄酮含量增加，异荭草素含量增加；干扰株系中总黄酮含量减少，异荭草素含量减少，调控异荭草素合成的关键基因黄酮3'单氧化酶基因在过表达株系中上调，在干扰株系中下调。上述结果为进一步研究TZF2调控黄酮合成提供可靠的表型依据。