基于Rictor/mTORC2信号通路分子枢纽致大隐静脉移植物内膜增生的机制研究

The saphenous vein is the most common graft in coronary artery bypass grafting, but the long-term patency rate is low. So how to prevent the restenosis is of great clinical significance. Our previous study found that Rictor/mTORC2-PKCα can promote endothelial cell proliferation and angiogenesis. Rictor/mTORC2-PKCα could be activated and sustained enhancement after vein graft transplantation. We hypothesized that the abnormal activation of mTORC2 is the key factor to promote the saphenous vein intimal hyperplasia, suppressing mTORC2 overexpression may be contribute to prevent saphenous vein graft restenosis. In order to verify this hypothesis, we first set up the human-mouse chimeric vein model and primary culture the human saphenous vein endothelial cells. Applying with the gene edit technology-CRISPR/dCas9 system and recombinant lentivirus technology, by changing the Rictor/PKCα expression, we observed Rictor/mTORC2-PKCα axis how to influence the saphenous vein endothelial cell biology behavior and suppress the saphenous vein intimal hyperplasia. To provide direct evidence of new therapeutic targets for preventing the saphenous vein graft restenosis .

大隐静脉是旁路移植术中最常见的移植物，但其远期通畅率较低，预防其再狭窄临床意义重大。我们前期研究发现Rictor/mTORC2-PKCα促进内皮细胞增殖和血管生成，静脉移植后Rictor/mTORC2-PKCα被激活且持续增强。我们假设mTORC2的异常活化是促进大隐静脉内膜增生的关键因素，抑制mTORC2的过度表达有助于预防移植静脉再狭窄。为验证该假设，我们利用人大隐静脉内皮细胞和人鼠嵌合静脉移植模型，应用基因编辑技术-CRISPR/dCas9以及重组慢病毒技术，通过改变Rictor/PKCα的表达，观察Rictor/mTORC2-PKCα轴对大隐静脉内皮细胞生物学行为的影响及抑制移植物内膜增生的情况。为寻找预防移植静脉再狭窄新的治疗靶点提供直接证据。

我们依据“mTORC2的异常活化是促进大隐静脉内膜增生的关键因素，抑制mTORC2的过度表达有助于预防移植静脉再狭窄”的假设，围绕“mTORC2→Rictor→PKCα→移植静脉再狭窄”主线，构建人鼠嵌合静脉移植模型，得到再狭窄的移植后静脉，并检测mTOR、Rictor表达。构建CRISPR/dCas9-Rictor慢病毒表达与干扰载体，制备Rictor转基因HUVEC，观察HUVEC的生物学行为改变，Western blot检测Rictor、PKCα、4EBP蛋白的表达，确认在体内外mTORC2信号通路对血管内皮细胞增殖具有促进作用。为进一步明确mTORC2作用的分子机制，对构建的再狭窄模型取样进行基因芯片分析，得出静脉移植物再狭窄过程中可能发挥重要作用差异基因，及这些基因所在通路、控制的生物学行为等；并从中选取S100蛋白家族，验证其对静脉移植物再狭窄的作用，结果显示S100A8和S100A9通过RAGE受体介导的mTORC2通路靶点促进内皮细胞活化。最后，为了探究白藜芦醇改善内皮细胞功能的作用是否与mTORC2通路相关，我们构建过表达Rictor的HUVEC，加入白藜芦醇干预并检测HUVEC生物学行为及Rictor的表达，发现白藜芦醇能通过抑制Rictor表达从而缓解HUVEC的增殖、迁移及管腔形成。该课题证明mTORC2可能为移植静脉再狭窄的重要分子通路，并可作为新的靶点，为研究静脉移植物再狭窄保护药物奠定理论与实验基础。