中华绒螯蟹副性腺相关功能蛋白和基因的研究

副性腺对动物的生殖具有重要作用，而副性腺蛋白则明显影响着精子的功能状态和受精能力。因此，副性腺功能的研究对深入阐述动物的生殖机理具有重要的意义。本项目以中华绒鳌蟹为研究对象，采用蛋白质分离纯化、2-D蛋白质电泳、蛋白质质谱等方法和手段 ，通过逐级分离、鉴定以及蛋白质差异分析，获得相关功能蛋白，确定蛋白的特性及部分氨基酸序列；同时，通过构建副性腺不同发育期差减基因表达文库，获得副性腺不同发育期的差异表达基因，采用生物信息学的方法，结合哺乳动物已有研究成果，确定副性腺中与生殖相关的功能基因。结合上述研究，利用已知蛋白序列和基因序列，设计特异引物，分析这些功能基因在组织中的时空表达规律，探讨这些基因的功能及其作用机制。通过上述的研究，以期深入了解副性腺在中华绒螯蟹生殖中的作用，为全面阐述中华绒螯蟹的生殖机理以及该蟹的生殖营养调控和人工繁殖等提供重要理论参考。

利用抑制性差减杂交技术(SSH)和2DE蛋白质电泳及质谱技术，完成了副性腺发育早期和快速发育期的差减cDNA文库构建，获得170余条高质量ESTs序列，并对与顶体反应中钙离子释放密切相关的基因TCTP进行克隆和表达分析，以及其他生殖相关基因，如泛素途径相关的SUMO-1、Ubc9以及另外两个 ubiquitinribosomal fusion protein基因分别进行克隆和功能分析，逐步阐明中华绒螯蟹生殖相关的泛素化调节途经。另外通过对副性腺组织的cDNA构建获得了副性腺发育高峰期与生殖相关的很多重要功能基因，并对这些基因逐一进行全长克隆和功能研究，包括leptin receptor、Es-FABP9、Es-FABP、cathepsin A、cathepsin C、cathepsin L、Selenoprotein M、macrophage migration inhibitory protein (MIF)、caspase and nm23等等，分别对这些基因的表达水平和其他物种该基因的同源比对建立系统进化分析，在中华绒螯蟹中开展了大量的基础研究工作，为生殖机理的阐明提供了大量候选基因。.另外，我们在该项目资助下首次发现中华绒螯蟹副性腺分泌蛋白可以破裂精荚释放活性完好的游离精子。本研究通过不同温度和副性腺蛋白浓度的二因子正交试验，以完全消化精荚所需时间为依据，研究了副性腺蛋白消化精荚从而获得游离精子的最佳反应条件（32℃，15.4 mg/ml），进一步分析发现副性腺蛋白浓度是影响精荚消化的主要因子。与此同时，比较了副性腺蛋白消化法、胰蛋白酶消化法和机械匀浆法所获游离精子的死亡率，结果发现副性腺蛋白消化法得到的精子死亡率最低（1.94±0.29﹪）而顶体酶活力最高，机械匀浆法得到的精子死亡率最高（22.28±0.48﹪）而顶体酶活力最低，三者间均存在显著性差异（P＜0.05）。.在上述研究结果的基础上，我们进一步采用亲和柱层晰方法对副性腺内容物组分进行纯化并分析各组分消化精荚的效果，确定具有最高消化精荚活性的组分利用SDS-PAGE方法分离以后进行Shot-gun质谱鉴定分离获得起到关键消化作用的蛋白成份为Cathepsin A蛋白，进而确认该蛋白在副性腺分泌蛋白中的含量，初步阐明中华绒螯蟹副性腺对精荚破裂过程的作用方式。.