中华绒螯蟹精子膜蛋白组成及其修饰机理的研究

精子膜蛋白修饰是精子成熟、获能、完成顶体反应并最终完成受精过程的重要环节和保障。本项目采用蛋白质串联质谱（LC-MS/MS）技术，结合生物信息学分析，较全面地了解中华绒螯蟹精子膜蛋白的组成结构以及在受精中的功能特点；采用i-TRAQ多重化学标记串联质谱技术，系统分析不同生殖道蛋白对精子膜蛋白的修饰作用，确定精子膜蛋白被修饰的种类、修饰的方式以及这些被修饰蛋白在生殖过程中的生理功能；采用Pull-Down或免疫共沉淀等技术，找出修饰精子膜蛋白的作用蛋白，确定这些作用蛋白的来源及功能；根据质谱分析所获得的氨基酸序列，克隆重要功能蛋白基因，研究这些基因的结构以及在不同发育期的表达模式。综合上述研究结果，全面分析中华绒螯蟹精子膜蛋白的修饰机理以及生殖道蛋白在受精过程中的作用，初步阐明该蟹雄性生殖的分子机制，为该蟹人工养殖业的发展提供坚实的理论支撑。

通过比较TM-PEK试剂盒法和TritonX-114液相分离法发现，TM-PEK试剂盒法效率要高于TritonX-114液相分离法。利用TM-PEK试剂盒法抽提获得精子膜蛋白，经质谱鉴定共识别765个非冗余蛋白，369个有GO注释，其中181个注释蛋白是膜蛋白。使用TMHMM 2.0 algorithm识别出109个至少含有一个跨膜结构域的蛋白。使用ExPASy的ProtParam工具分析蛋白的GRAVY值，GRAVY值的范围是−3.114至1.127，其中129个蛋白为正值。由于中华绒螯蟹精子膜蛋白的提取存在一定的困难，不同方法获得的精子膜蛋白均有一定的局限性，因此还需进一步探讨精子膜蛋白的提取方法。.结合转录组，通过设计兼并引物克隆及western blot等实验结果发现在中华绒螯蟹中仅存在一个Cul4亚型，Cul4在精巢发育的早期表达量相对较高，且主要表达在精母细胞的胞质中；通过全基因组分析证实，中华绒螯蟹Cullin家族一共存在5个亚型，其中Cul1, Cul3和 Cul4在雄性生殖腺组织表达量较高，并随着精子发育成熟而降低，同时发现Cul4与P53、PCNA及其底物蛋白(P21、P27)在精巢发育不同时期的表达趋势一致；通过添加NAE酶抑制剂MLN4924证实，Cul4参与了类泛素化修饰，调控细胞周期进程，从而影响精子发生过程。此外，通过基因的表达分析、免疫荧光、免疫组化、western blot以及免疫共沉淀等方法，初步证明：Es-DDX6参与了中华绒螯蟹精巢和卵巢组织的发育，并且主要参与了卵母细胞生长过程；Es-ADAM10和Es-ADAM17可能参与了中华绒螯蟹精母细胞的凋亡过程，以调控精子质量；Esserpin-3在精子发育和成熟过程中发挥重要功能，推测Esserpin-3可能以与HongrES1和Protein CInhibitor相同的方式作为一种去获能因子参与调控中华绒螯蟹顶体反应；在中华绒螯蟹卵巢发育成熟时期，FOXL2一方面与DDX20相结合调控卵母细胞周围滤泡细胞的凋亡，从而阻止卵母细胞通过滤泡细胞从血淋巴中吸取VTG；另一方面，FOXL2与FTZ-F1相结合可能参与调控类固醇激素合成过程中P450芳香化酶的表达，从而调控类固醇激素的合成，最后通过阻止类固醇激素的合成来抑制类固醇激素促进脂肪体释放VTG。