FOXL2调控中华绒螯蟹外源性Vg合成和吸收机制的研究

Vitellogenin(Vg), as a female-specific reproductive related protein, is the precursor of vitellin(Vn) in oviparous non-mammalian. Vg can be cleaved into phosvitin (Pv) and lipovitellin (Lv), stored in egg, providing the nutrients and energy for developing embryos. Study on synthesis, transport and function of Vg and its degradation products is extremely important to elucidate the embryonic development mechanism of oviparous animal. The Chinese mitten crab is one of the important aquaculture species, the research on reproductive biology has been great concerned. However, the molecular mechanism of Vg synthesis and transport is unclear. Therefore, this proposed project is to scree the genes related to synthesis and transport of Vg, and verify the sequence, based on the gonadal transcriptome and genome-wide data. Using ChIP, EMSA and other techniques, to verify the target CYP and the specific binding sites regulated by FOXL2 transcription factor, and to analyze the regulation of FOXL2 and FTZ-F1 onCYP, CYP on sex steroid hormone synthesis, hormone-receptor complex on Vg, and VgR-mediated endocytosis mechanism, preliminary elucidating the molecular mechanism of Vg synthesis and transport in the Chinese mitten crab.

卵黄蛋白原（Vg）是非哺乳类卵生动物卵黄蛋白Vn的前体，可被裂解为卵黄高磷蛋白（Pv）和卵黄磷脂蛋白（Lv）储存在卵子中，为胚胎发育提供主要营养和能量来源。深入探讨Vg及其降解产物的形成、转运以及相关功能，对阐明卵生动物胚胎发育机制具有极其重要的意义。中华绒螯蟹是我国重要水产养殖物种之一，其生殖生物学方面的研究一直备受关注，但关于Vg合成和转运的分子调控机制尚不清楚。为此，本项目拟根据已获得的中华绒螯蟹性腺转录组及全基因组数据，筛选并验证与Vg合成和转运相关的基因，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）和凝胶迁移（EMSA）等技术，确定FOXL2转录因子调控的靶标CYP及作用位点，分析FOXL2和FTZ-F1对靶标CYP的调控方式，CYP对性类固醇激素合成的调控，激素-受体复合物对Vg表达的调控，以及VgR介导的内吞作用机制，初步阐明中华绒螯蟹Vg合成和转运的分子机理。

卵黄蛋白原（Vitellogenin, Vg）是卵黄蛋白的前体，作为胚胎早期发育营养和能量的主要提供者广泛存在于卵生动物之中。越来越多的证据表明Vg在生殖细胞发育及宿主免疫防御中均具有重要作用。本项目对中华绒螯蟹Vg调控卵巢发育，以及Vg不同功能域差异化协同调控不同免疫功能输出的分子机制进行了研究。我们基于中华绒螯蟹基因组测序结果及大量克隆数据明确了中华绒螯蟹Vg基因全长7939bp，ORF区包含2567个氨基酸，该基因包含三个结构功能域：LPD_N 结构域、DUF1943 结构域及 VWD 结构域。Vg 主要表达在卵巢及肝胰腺，卵巢组织的Vg主要表达于细胞核内，且随着卵巢的发育进行快速的积累。本项目克隆获得了卵黄蛋白原受体VgR的 cDNA 部分序列，VgR 仅在中华绒螯蟹卵巢组织中特异性表达，暗示 VgR参与了卵巢发育过程。同时，随着卵巢的发育VgR表达量逐渐升高，在卵巢发育后期表达量又有所下降。而 Vg 的表达趋势与 VgR类似，暗示 Vg 与 VgR共同参与了调控卵巢发育过程。此外，通过构建Vg三种功能域重组蛋白，细菌结合实验及流式细胞术等方式阐明了Vg不同功能域通过结合细菌，抑菌及促进血细胞吞噬等不同方式参与中华绒螯蟹天然免疫反应。利用免疫共沉淀，RNAi和流式细胞术等技术手段确认了血细胞上的多聚免疫球蛋白受体（pIgR）能够与Vg功能域结合并共同促进血细胞吞噬病原。以上研究结果明确了Vg在调控卵巢发育及血细胞免疫中具有的重要功能，明确了Vg不同功能域调控差异化生物学功能输出的分子机制，为甲壳动物生殖免疫学的研究提供了重要依据。