茶树中“单宁酶”的性质研究及酶基因的筛选与功能分析

It is one of the important influence factors of the tea quality that the tea infusions has too much astringency. It is the foundation of exploring the tea plant which has low-acerbity that research the genes of "tannase" from tea. But it has not been clear on properties and molecular bioinformatics of tannase in plant. Previously, there are already signs of substantive progress .From the view on enzymology , the hydrolytic action of "tannase"in tea plant are proved for the first.On the basis of the rusult，the work is to isolate and purify "tannase" in tea plant ,and analyze theirs enzymology and structure information via protein purification, mass spectrum identification technology. Using immunocytochemical techniques, detect the sites of subcellular localization of tannase. With strategies of funetional cloning ,screen the candidate EST and ORF sequences in enzyme genes from database of transcriptome and genome of tea plant. Clone the full- length of the genes. Test and verify the genic functions basing on pronucleus expression.The work is important, in the theoretical significance and actual value, to ascertain the enzymology characteristics and gene information of "tannase"in tea plant .It is not only good to improve the natural quality of tea,but also efficient utilization the low-acerbity resources of tea plants in our country.

茶叶苦涩滋味重是影响茶叶品质的重要因子之一。茶树中"单宁酶"基因的挖掘，是寻找及开发低涩味茶树资源的基础。植物单宁酶的性质乃至分子水平的了解几乎空白。我们前期研究首次从体外酶学角度证实了茶树中"单宁酶"的水解催化作用。本项目拟在前期工作基础上，利用蛋白质分离纯化、质谱鉴定等技术，对茶树中"单宁酶"进行分离纯化，并分析其酶学性质和蛋白质氨基酸序列信息；采用免疫组织化学技术，研究酶蛋白的亚细胞定位；采用功能克隆策略，从茶树转录组和基因组数据库中筛选酶基因的候选EST和ORF序列，克隆基因全长；通过原核表达验证基因功能。本研究旨在探明茶树中"单宁酶"的酶学特性，挖掘其基因信息；对于低涩味的优质茶树品种资源的高效利用和提高茶叶自然品质具有重要的参考和借鉴意义。

本项目实施过程中，针对项目任务书中的研究内容，逐条开展了工作。本项目已经完成的工作：.①利用酶蛋白分离-纯化-蛋白质胶条MS/MS 测序-转录组筛选的策略，从茶树和葡萄中获得了大量的 “单宁酶”的候选基因，并且获得了与酯型和非酯型儿茶素合成和水解相关的候选基因；.②利用候选基因信息，依托课题组和依托单位已经构建的茶树基因组全长ORF 数据库和转录组cDNA 数据库，比对、筛选与酯型儿茶素水解相关的候选基因，并从中筛选到四条“单宁酶”相关候选基因。并筛选到若干个与茶树类黄酮合成相关的结构基因及转录因子基因。.③利用RACE 技术，克隆了包含四条“单宁酶”基因在内的与茶树酚类物质合成代谢相关的大部分结构及调节基因，且大多数基因正在进行功能分析。.④利用qRT-PCR和转录组测序、代谢组UPLC-3QMS/MS 测试技术，系统研究了这些基因在茶树不同器官、叶片不同发育时期、环境因子诱导的表达模式与茶树酚类物质合成与积累的相关性，研究结果发现，茶树酚类物质的合成与积累具有组织器官和发育特异性,诱导表达特异性。.⑤利用原核表达体系验证候选的“单宁酶”基因功能，确定“单宁酶”的基因信息，同时也用原核、酵母真核表达体系、烟草和拟南芥转基因体系，验证了绝大多数结构基因和相关转录因子的功能。.本项目基本完成了项目任务书预定的研究内容，明确了茶树中“单宁酶”的酶学性质，分析了其基因信息。本项目达到了项目立项的研究目标。.本项目实施过程中，培养硕士6 名。在国外期刊上发表2篇文章，国内期刊发表3 篇，授权专利1项。参加国际学术会议1次，国内学术会议2次。