VEGF-A modRNA 促进骨质疏松症骨再生机制研究

To explore the mechanisms of VEGF-A on promoting osteogenesis after osteoporosis, we will use the cell models of directed osteogenic differentiation/adipogenic differentiation of human mesenchymal stem cells(hMSCs) in vitro, then use animal models of osteoporosis in vivo. First we need to make VEGF-A modRNA. In vitro study to confirm VEGF-A contribution osteogenic differentiation and inhibition of adipogenic differentiation by detecting specific gene expression of osteogenic/adipogenic and phenotype of osteoblasts/adipocyte，after overexpression of VEGF-A through graded importing VEGF-A modRNA or transfecting CRISPR-Cas9 to knockout VEGF-A gene. In vivo, we will make mouse model of osteoporosis-ovariectomy(OVX), then inject VEGF-A modRNA. After injection of VEGF-A modRNA for 4, 8 and 12 weeks, we will detect bone histomorphometry, bone ultrastructure, bone mineral density and specific gene expression. At last to observe the effect of VEGF-A modRNA on promoting osteogenic differentiation and inhibition of adipogenic differentiation, in vivo to further confirm VEGF-A modRNA promoting on bone regeneration in osteoporosis animal. Our aim is to provide new idea and new method for the treatment of osteoporosisand and stem cell-mediated regenerative medicine.

项目以体内外二个研究层面为视角，沿着VEGF-A平衡调控成骨和成脂分化的思路，朝着阐述VEGF-A modRNA促进骨质疏松骨再生机制的目标开展工作。体外研究采用hMSCs成骨和成脂诱导法构建细胞分化模型，运用导入VEGF-A modRNA或转染CRISPR-Cas9上或下调VEGF-A表达的策略，应用细胞分化表型特征与特异基因相结合的方法，分析各组不同时点成骨和成脂分化能力，探讨VEGF-A平衡调控hMSCs成骨和成脂分化机制。体内以OVX小鼠模型为对象，利用分次注射VEGF-A modRNA导致病损区脉冲表达VEGF-A的方法，在4、8和12周后，使用骨形态计量、显微CT、超微结构分析和检测分化特异基因等定性定量方法评价骨再生效能，证实VEGF-A modRNA借助脉冲表达VEGF-A的方式增强成骨同时抑制成脂，促进骨质疏松病损区骨再生，为治疗骨质疏松与干细胞介导的再生医学提供新思路。

在成人骨骼中骨髓间充质干细胞（human Mesenchymal Stem Cells, hMSCs）定向分化为成骨和脂肪细胞的比例失衡（成骨细胞减少、脂肪细胞增多），将导致骨量下降，是骨质疏松发生发展的关键因素。采用旁分泌因子VEGFA165的人工修饰RNA（modRNA）转染hMSCs，以重编程方式增强成骨同时减弱成脂能力，达到恢复骨质疏松患者骨量的目的。. 本项目研究完成了体外转录模板构建和人工合成 VEGF-A165 modRNA，完善了VEGFA165 modRNA高效转染 hMSCs的方法，并确定最优转染剂量；探讨了多次转染VEGFA165 modRNA实现脉冲表达VEGF-A方法的可行性。从hMSCs表面分子及成脂/成骨特异性基因表达等多个角度，系统阐明了采用无血清培养及诱导体系的合理性。实施了成脂诱导0、7、14、21和28天表达组动态测序，获取了mRNA、miRNA表达水平、AS事件发生频率及类型、细胞代谢与成脂分化过程的时空关系相关数据,为hMSC成脂分化的研究提供了新的思路。. 在hMSCs（原代细胞）中转染VEGF-A165 modRNA效率达95%，明确VEGF-A modRNA 250ng/2ml为最优转染剂量，多次转染实现脉冲表达VEGF-A方法可行，为VEGFA165 modRNA后续研究奠定了基本条件。. 证明在调控成骨和成脂定向分化体外研究中，采用无血清培养及诱导体系更加合理，建立的稳定的无血清hMSCs分离、培养体系，优化的无血清成脂与成骨诱导方法，为相关研究及临床应用提供了可靠方法。. 明确了成脂分化过程与潜在关键基因、miRNAs表达和AS的时空关系，为深入研究hMSC成脂分化的调控机制指明了方向；从细胞代谢角度诠释成脂分化转录水平动态变化，阐述了细胞代谢与成脂分化过程转录水平的时空关系，为hMSC成脂分化的研究提供了新的思路。