利用光控shRNA-NF1基因特异敲减小鼠研究Ras-MAPK信号通路在多动症中的作用机制

Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) is a childhood psychological and behavioral disorder, and the pathogenesis is unclear. Genetic is the major factor for ADHD, but with the lack of the mice model for the pathogenesis research, the pathogenesis remains unknown. Neurofibromatosis 1 (NF1) is one of the most common single gene disorders. Among the children who suffer from NF1, 80% present people show cognitive impairment on learning, attention and other aspects, which heavily affects their family and school life. On the other hand, up to 50% of the patients can be diagnosed as ADHD. Fortunately, NF1 is a single-gene disease as mentioned above, the knockout and knockdown of the gene in mice will help us to explore the gene function in the pathogenesis of ADHD. We have found that Ras-MAPK pathway plays an important role in the cognitive impairment of NF1 mice in our early researches. Our hypothesis is that NF1 gene disability lead to ADHD by increasing the activity of Ras-MAPK in the specific brain regions like prefrontal and corpora striatum. In order to test and verify the hypothesis, we plan to use shRNA-NF1 knockdown mice model which could be controlled by Optogenetics means to explore the pathway of ADHD pathogenesis. Additionally, with the collection of the ADHD children's blood samples, we will detect the expression profiles and methylation level of the molecules of the NF1-Ras-MAPK signal pathway. To conclude, this project is aiming at providing a new scientific basis for the pathogenesis and constructive treatments of ADHD.

多动症（ADHD）发病机制尚不清楚，已知遗传因素占主导作用，但用于研究发病机制的基因小鼠模型还很匮乏。I型神经纤维瘤（NF1）是最常见的单基因遗传疾病之一，80%的NF1儿童表现为学习、注意力等认知障碍,近50%的NF1患儿可以诊断为ADHD。由于NF1是单基因病，成功的基因敲除和敲减小鼠模型使我们可以深入探讨其在ADHD中的致病机理。我们前期研究发现Ras-MAPK通路在NF1小鼠认知障碍中起着关键的作用，我们假设：NF1基因缺陷通过在前额叶、纹状体等ADHD相关重要脑区上调Ras-MAPK通路活性导致ADHD。为验证该假说我们计划（1）利用光遗传学调控的shRNA-NF1小鼠模型研究NF1造成ADHD的发病机理；（2）通过收集临床ADHD儿童血样检测NF1-Ras-MAPK信号通路分子的表达与甲基化水平。本课题将为多动症的发病机制和治疗思路提供新的科学基础。

注意力缺陷多动症（ADHD）是一类常见的精神疾病，主要表现为多动、注意力不集中和冲动，但是部分患者学习困难等症状。目前对于多动症（ADHD）发病机制尚不清楚，临床上发现多数ADHD患者的生物节律失调。I型神经纤维瘤（NF1）是最常见的单基因遗传疾病之一，80%的NF1儿童表现为学习、注意力等认知障碍，近 50%的NF1 患儿诊断为ADHD。由于NF1是单基因病，通过小鼠模型可以帮助我们理解和揭示ADHD可能的致病机理。我们（1）利用构建的shRNA-NF1基因慢病毒载体感染小鼠前额叶区域敲减NF1的表达，观察其对小鼠行为的影响，旷场实验统计结果显示，实验组小鼠的活动度稍高于对照组，但两组结果并无显著性差异；（2）收集儿童首发多动症血样并提取外周血单核细胞，以分析NF1-Ras-MAPK 信号通路的表达及甲基化水平；目前在上海市第一人民医院收集到近20例儿童首发多动症血液样本，完成提取外周血单核细胞， NF1-Ras-MAPK 信号通路表达及甲基化水平正在检测分析中。（3）利用实验室已有NF1基因敲除小鼠模型对其白天黑夜（昼夜）的学习记忆行为的差异进行测定，结果发现，NF1敲除小鼠在昼夜两个时段学习记忆行为上有显著差异而WT小鼠没有区别。另外通过蛋白水平实验检测发现NF1缺陷小鼠的Ras-MAPK信号通路的昼夜表达也存在节律上的异常；利用在体多通道阵列电极系统记录NF1敲除小鼠昼夜脑电，检测学习记忆相关脑电波的变化，发现NF1敲除小鼠的theta波强度在白天黑夜均显著低于野生型小鼠。大脑中的theta脑电波与学习记忆能力息息相关，NF1敲除小鼠所表现出的theta脑电节律异常或许是导致其行为、MAPK表达水平异常的原因；以上结果提示我们昼夜节律可能引起的MAPK表达以及theta波异常可能是ADHD患者学习记忆障碍发生的机制之一，这为我们今后ADHD的治疗提供了新的方向。目前本项目成果已整理形成学术论文一篇，在准备投稿阶段。本项目培养博士后一名（已出站），博士研究生四名（其中一名已毕业），硕士研究生一名（已毕业）。