调气燥湿法调控抗氧化应激Keap1/Nrf2/ARE信号通路抑制肠“炎-癌”转化进展的效应机制

Oxidative stress plays an important role in multiple stages of colitis assocaited carcinoma. Based on the clinical effiency of Tiao-Qi-Zao-Shi method and our previous experimental data, AOM / DSS-induced chronic colitis carcinogenesis mouse model is chosen to explore the dynamic regulation roles of Shao-Yao-Tang on the oxidative stress signaling pathway, Keap1 / Nrf2 / ARE, and its anti-oxidant effects on the progression of chronic colitis transformation to carcinoma; In vitro experiments, oxidative stress model and oxidative stress induced inflammation model are established to explore the mechanisms of oxidative stress-induced inflammatory response to intestinal epithelial cell injury and the protection mechanisms of Shao-Yao-Tang drug serum. Using a variety of molecular biology methods to detect oxidative stress related proteins and the proteins from the key signal pathway with anti-oxidant role, Keap1 / Nrf2 / ARE, and its downstream targets, HO-1, NQO1, UGT1A1, GSTM1; oxidative stress-induced inflammatory related protein (p-NF-κB (p65), p65, COX-2, iNOS), proliferation and apoptosis proteins and inflammatory cytokines will be detected too. To comprehensive and systematic exploration of the impact of oxidative stress on chronic colitis associated carcinoma, reveals the molecular mechanisms of anti-oxidative stress of Shao-Yao-Tang under the guidance of Tiao-Qi-Zao-Shi method in colitis assciated carcinoma prevention and treatment, and supply practical evidence for colon cancer prevention and treatment.

氧化应激在慢性肠炎癌变疾病进展的多阶段起着重要作用。在确认调气燥湿法防治肠癌有效的前提下并基于前期工作积累，本研究拟选取AOM/DSS诱导的慢性肠炎癌变小鼠模型，动态探究具有调气燥湿功效的芍药汤调控抗氧化应激信号通路Keap1/Nrf2/ARE发挥抗氧化作用对肠“炎-癌”转化进展的保护机制；体外建立氧化应激损伤、氧化应激炎性反应模型，探究氧化应激及氧化应激诱导的炎性反应对肠上皮细胞的损伤机制和芍药汤的保护机制。采用多种方法对氧化应激相关蛋白及抗氧化通路Keap1/Nrf2/ARE调控的多个蛋白HO-1、NQO1、UGT1A1、GSTM1进行检测；并对氧化应激诱导的炎性相关蛋白（p-NF-κB(p65)、p65、COX-2、iNOS）、增殖凋亡蛋白及炎性因子进行检测，系统探究氧化应激对肠炎癌变的影响，以期揭示调气燥湿法指导下的芍药汤抗氧化应激损伤防治肠炎相关性癌变的效应机制。

本研究拟选取AOM/DSS诱导的慢性肠炎癌变小鼠模型，通过整体动物实验和细胞学实验，动态探究芍药汤调控抗氧化应激信号通路Keap1/Nrf2/ARE发挥抗氧化作用对肠“炎-癌”转化进展的保护机制。动物实验研究结果：1.病理学评价AOM/DSS诱导肠炎癌变情况：与AOM模型组比较，芍药汤各组小鼠体质量减轻较少、均能明显抑制结肠缩短、显著减少肿瘤数量（p<0.01）。2.定量RT-PCR检测结直肠组织中抗氧化信号通路Nrf2关键指标的表达，结果显示：与AOM比较，芍药汤高剂量组各时间点GR、TR、HO-1、UGT1A1的mRNA表达水平，第63、98天，NQO-1 mRNA及第28、63天UGT1A10、γ-GCSc mRNA表达水平均显著升高（p<0.05，p<0.01）。3.免疫组化检测结直肠组织炎症和肿瘤形成指标，结果显示：芍药汤各剂量组第98天NF-κB、Ki-67表达水平显著降低（p<0.01）。4.Elisa法检测结直肠组织炎性细胞因子和氧化应激蛋白水平，结果显示：第63、98天TNF-α及IL-β表达水平显著降低（p<0.05，p<0.01）；芍药汤高、中剂量组各时间点SOD活性增强（p<0.05，p<0.01），芍药汤各剂量组各时间点MDA含量减少（p<0.01）。体外研究结果显示：1.与模型组比较，SYD组Ki-67和NF-κB的阳性表达率明显降低（p<0.05）。2.与模型组比较，SYD组TNF-α和IL-1β水平明显降低（p<0.05）。3.SYD显著降低了HT-29细胞的活力（p<0.05，p<0.01），并呈时间和剂量依赖性。4.与模型组相比，SYD治疗组细胞质和细胞核中Nrf2蛋白表达显著增加（p<0.01），对于Nrf2基因敲除实验组，两组之间在细胞质和细胞核中的Nrf2表达均无显著差异。5.与模型组相比，SYD组细胞质中keap1的表达显著下调（p<0.01）；敲除Nrf2对细胞核中keap1的表达没有明显影响。6.与模型组相比，Nrf2+/SYD组UGT1A1，GSTM1，HO-1 和NQO1表达显著升高；与Nrf2-/SYD组相比较，Nrf2+/SYD组沉默Nrf2可显著抑制SYD诱导的UGT1A1、GSTM1、HO-1和NQO1的表达。7.SYD组内比较，Nrf2（+）HT-29细胞MDA水平较低，SOD水平偏高（p<0.005）。