利用人工microRNA技术改良水稻抗虫性的应用及其分子机理的研究

RNA干扰（RNAi）是一种RNA介导的基因沉默机制。人们利用RNAi机理发展出了多种基因沉默的技术，如发卡RNA（hpRNA）或人工microRNA（amiRNA）技术，它们在植物功能基因组研究和作物品种改良等方面均有巨大的应用价值。2007年两个研究小组证实利用表达外源双链RNA（dsRNA）的转基因植物喂饲昆虫，可以特异性的沉默昆虫目标基因的表达，抑制昆虫的生长，为培育抗虫植物提供了新思路。本研究以水稻二化螟为测试昆虫，首先利用体外表达喂饲测试鉴定出控制二化螟生长发育的关键基因，再通过关键基因的序列设计出相应amiRNA序列并构建表达载体转化水稻。利用转基因水稻喂饲二化螟，通过分子技术检测二化螟内目标基因表达和翻译状况揭示其基因沉默的机理，研究转amiRNA水稻的抗虫机制，为探索出一种可以控制水稻虫害的"通用"技术奠定基础。

通过构建二化螟幼虫全组织全生育期平衡化的EST文库并进行测序获得二化螟的EST序列。参考数据库中高同源性的已知蛋白质的功能注释，对二化螟EST序列进行注释。参考Baum等（2007）发表的结果，挑选进行RNAi的候选基因。根据候选基因的EST序列设计dsRNA。体外表达dsRNA并通过二化螟喂饲试验，筛选了5个对二化螟生长发育有显著影响的关键基因作为RNAi的靶基因，并命名为WH1-5。体外喂饲试验表明，WH1和WH2的dsRNA可以导致喂饲的二化螟幼虫死亡率显著上升，WH3-5的dsRNA可导致喂饲的二化螟幼虫体重显著下降。利用WH1-5的EST序列设计10条的amiRNA序列（每个基因对应2条）和5条dsRNA序列，构建amiRNA和dsRNA的表达载体。通过农杆菌介导的遗传转化方法将这些表达载体导入水稻品种中花11。实验室人工接虫鉴定结果表明，4个载体相应的转基因水稻茎秆对喂饲二化螟幼虫有生长抑制效果，其中WH2-amiRNA-2载体的转基因水稻对喂饲的二化螟的生长抑制效果最明显。通过real-time PCR方法检测喂饲WH2-amiRNA-2转基因水稻的二化螟幼虫靶基因WH2的表达，表明靶标基因的转录本没有显著下降，推测WH2-amiRNA-2导致翻译抑制，而非转录本剪切。另外，我们收集了二化螟6个不同生长发育时期的样本（卵、1-2龄幼虫、3-4龄幼虫、5龄幼虫、蛹和成虫）分别建立小RNA库。对6个小RNA库进行高通量测序，通过生物信息学分析预测出6个二化螟样本中保守的miRNA和新 miRNA。挑选4个二化螟的新miRNA序列（csu-novel-miR15, 22, 46, 83）构建人工miRNA表达载体。通过农杆菌介导的遗传转化方法将表达载体导入到水稻中。选取amiRNA表达量高的植株进行二化螟接虫鉴定。结果表明，转化csu-novel-miR15的水稻对喂饲的二化螟幼虫生长有明显抑制效果，转化其余3种二化螟新miRNA的水稻抗虫效果不明显。整体上看，转化amiRNA表达载体的水稻抗虫效果好于转化dsRNA表达载体的水稻。Real-time PCR分析表明喂饲amiRNA水稻的二化螟体内相应靶基因表达水平变化不明显，暗示amiRNA通过翻译抑制来沉默基因功能，该假设还需要进一步通过Western杂交进行验证。