缺氧诱导因子HIF-1α调控SCF/KIT途径在肢端黑素瘤发病机制中的作用研究

恶性黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤，其发病与基因和信号转导途径的异常及肿瘤微环境有关。KIT基因异常最常见于肢端黑素瘤，目前对于该基因及其传导途径（SCF/KIT）在肢端黑素瘤发病机制中的作用尚未明确。新近发现低氧微环境产生的HIF-1α能诱导黑素细胞转化和肿瘤生长，而SCF的5'启动子端有HIF-1α结合位点，因此推测HIF-1α可能导致SCF/KIT途径异常活化。本研究以中国人最常见的肢端黑素瘤为研究对象，首先检测肢端黑素瘤中KIT基因和HIF-1α表达情况，筛选常见的KIT突变类型；其次构建稳定表达野生和突变型KIT基因的细胞株；最后在缺氧环境下，采用三维球体和组织工程皮肤模型模拟肿瘤微环境，用小干扰RNA抑制HIF-1α的表达，观察SCF/KIT及下游信号通路和细胞生物学变化。探讨在肢端黑素瘤发生发展中，HIF-1α调控SCF/KIT途径的机制，并为肢端黑素瘤的靶向治疗提供理论依据

本研究采用免疫组化、PCR、DNA测序的方法在人肢端黑素瘤组织标本中检测了c-kit和HIF-1a蛋白表达和KIT基因突变的情况；采用慢病毒载体、RNA干扰、qPCR等技术在体外对人黑素瘤细胞A375的HIF-1a RNA合成进行干扰，观察下游信号通路的变化；根据临床标本KIT基因突变的情况，成功构建含有KIT突变基因的细胞株。本组研究是目前为止，对亚洲黄色人种肢端黑素瘤c-kit表达和KIT基因突变的情况最大病例数的一组研究。我们发现（1）90.3%的肿瘤表达c-kit，其表达水平与肿瘤的临床病理特征均未见明显相关，而KIT基因的突变率为3.5%，最常见的突变位点是11号外显子的L576P，KIT基因突变和蛋白表达没有一致性。（2）87.1%的患者表达HIF-1α，与正常肢端皮肤组和肢端黑素细胞痣组相比较，肢端CMM中HIF-1α的表达增高，差异均有统计学意义（P<0.01）；在肢端CMM和非肢端CMM的侵袭性肿瘤组间，具有统计学差异（P<0.01）。HIF-1α表达水平与肿瘤Clark分级、Breslow厚度及肿瘤侵袭程度均呈正相关。在AMM中，HIF-1α表达还与c-kit表达呈正相关。（3）在人黑素瘤细胞A375中，用慢病毒sRNA干扰HIF-1α的表达后，发现肿瘤细胞增殖率及克隆形成能力下降，凋亡增加，我们也初步证实，这些变化可能是通过SCF-P13K-AKT途径，而不是通过MAPK途径活化后调控的。（4）构建成功含KIT突变基因的人黑素瘤细胞株，为进一步研究HIF-1α和SCF/KIT途径在人肢端黑素瘤发生中的相互作用打下基础。