抗生素类小分子诱导绿脓杆菌耐药性的信号传导调控

绿脓杆菌是引发医院内部感染的主要致病病原体之一，其产生的耐药性菌株使许多抗生素失去了正常疗效，发展全新策略应对这些病原体是目前迫切需要解决的问题。MexR转录因子调控细胞膜外排泵基因mexAB-oprM操纵元是引起绿脓杆菌产生多药耐药性的重要途径。研究还发现绿脓杆菌中的NalD和NalC也参与调控着mexAB-oprM操纵元的表达，然而小分子抗生素是如何诱导这两个转录因子的机制尚不清楚。因此综合运用多学科交叉互补的研究手段，在分子、细胞等不同层次上深入阐明绿脓杆菌是怎样感知小分子抗生素信号，以及通过何种途径去控制多药耐药性具有极其重要的意义。本申请项目的成功开展将有助于了解绿脓杆菌以及其它病原菌产生耐药性的分子机制，为今后治疗病原菌所引起抗药性提出新的理论依据，为基于新策略、新靶标的抗菌药物研发奠定坚实的实验基础。

本研究项目以易发生院内感染、具有内在多药耐药性的绿脓杆菌为对象，研究小分子抗生素是如何激发信号传导途径，诱导NalD和MexR等转录调控因子发生去阻遏作用，激活绿脓杆菌主要药物外排泵体系MexAB-Oprm，从而产生多药耐药性的分子机制。. 在这三年的研究里，本课题组利用Thermal shift assay高通量筛选、凝胶迁移实验（EMSA）以及微量量热滴定（ITC）等方法，首次确定NalD转录调控因子的小分子抗生素靶标Novobiocin（新生霉素）；此外通过对apo-NalD蛋白质晶体的成功解析发现， NalD与TetR蛋白质家族LfrR蛋白的晶体结构同源性很高，这也意味着抗生素调控NalD蛋白的作用机制与TerR蛋白质家族响应小分子作用的机制极为相似；并利用MIC实验和琼脂糖平板测试等体内实验，在细菌表型层次上验证转录因子NalD可以响应抗生素Novobiocin的诱导，从而调控MexAB-OprM外排泵产生耐药性。NalD蛋白质小分子抗生素靶标的首次确定，基本建立从“小分子抗生素垂钓”到“信号传导靶标确证”的研究模式，是本课题组在结合化学生物学、生物化学、微生物学和结构生物学等多学科交叉的综合性研究方法下获得的，其体内体外实验结果的相互印证，体现了学科交叉的优势，为今后相似研究体系的靶标确证提供了一定的借鉴方法。. 为了确定抗生素进入细菌体内后，细菌收到这些小分子化合物刺激以后，是如何产生氧化信号，最终激活MexAB-OprM多药外排泵的主要转录因子MexR的信号转导调控途径，本课题组建立和开展了基于2D-电泳的绿脓杆菌蛋白质组学平台。通过对小分子抗生素刺激和未刺激细菌上清抽提物的2D-电泳蛋白质组学图谱比对，再利用高性能的质谱表征手段鉴定差异蛋白质的ID。课题组发现Flavoprotein(黄素蛋白)等氧化呼吸链电子传递相关蛋白质在NAL（萘啶酸）等抗生素以及过氧自由基(Cumene Hydroperoxide ) 刺激绿脓杆菌后，其表达量会明显提高。这一方法的确定，将有利于最终揭示该信号转导调控通路。