马铃薯ERF转录因子相互作用蛋白质的筛选与鉴定

Ethylene response factor (ERF) is a kind of plant-specific transcription factors which play an important regulatory role in plant response to biotic and abiotic stress. At present, the regulation mechanism of transcription factor ERF and proteins interacting with them is not elucidated. In our previous study, the five genes of ERF family including StERF1-4 and Pti4 were cloned from potato, and the five StERFs can bind with GCC-box to involve in potato response to abotic stress including drought, NaCl, ethylene, sulphosalicylic acid and methyl jasmonate using yeast one-hybrid system. In the present research, yeast hybrid library will be constructed using potato materials under drought stress, and further screened novel potato ERF transcription factors and proteins interacting with them using yeast one-hybrid and yeast two-hybrid systems. The proteins interacting with ERFs will be verified by in vitro pull-down assay and in vivo co-Immunoprecipitation (CoIP). The aim of the research is to analyze mechanism of ERFs and their interacting proteins regulating potato drought resistance, and elucidate molecular mechanism of ERF regulating drought resistance of potato, and provide the molecular foundation for genetic improvement of stress resistance of potato.

乙烯响应因子(ERF)是植物所特有的一类转录因子，在植物响应生物及非生物胁迫中起着重要的调节作用。目前，在马铃薯中关于ERF转录因子及与其相互作用的蛋白质的调控机制还不清楚。在前期研究中，我们从马铃薯中克隆了ERF家族的5个基因StERF1-4和Pti4，并通过酵母单杂交系统验证表明马铃薯StERFs能通过结合GCC-box来参与对干旱、NaCl、乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯等非生物胁迫的响应。本研究将在此基础上，用干旱胁迫的马铃薯材料构建酵母杂交文库，然后用酵母单杂交和双杂交技术进一步筛选新的马铃薯ERFs转录因子及与其相互作用的蛋白质，用体外pull-down试验和体内免疫共沉淀(CoIP)方法对筛选得到的相互作用蛋白质进行验证，解析ERFs和其相互作用蛋白共同调控马铃薯抗旱性的机理，阐明转录因子ERF调控马铃薯抗旱性的分子机制，为马铃薯抗旱性的遗传改良提供分子基础。

乙烯响应因子（ERF）是植物所特有的一类转录因子，在植物响应生物及非生物胁迫中起着重要的调节作用。本项目对15个马铃薯StERF基因进行了生物信息学和表达分析，结果表明，除StERF3/10/12/120仅具有WLG结构域外，其余11个均具有YRG和WLG结构域。对15个StERFs基因上游2000 bp启动子区的顺式作用元件分析发现，其包含ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif和TCA-element等响应元件。qRT-PCR分析结果表明马铃薯StERFs基因在聚乙二醇（PEG6000）、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯(MeJA)和甘露醇等处理下表达模式不同，StERF79/72在5种处理下均上调表达，StERF156/5在水杨酸和甘露醇胁迫处理下均上调表达。通过对马铃薯植株进行4、8、12、16 d的干旱胁迫处理，测定了马铃薯叶片总蛋白质、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA），以及三种抗氧化酶：过氧化物酶（POD）、总超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等6个生理生化指标，结果表明，随着干旱胁迫时间的延长，Pro、MDA的含量显著增加；SOD、CAT的活性呈明显的上升趋势，POD活性虽有上升但趋势不明显；而总蛋白的含量减少。构建了用于单杂交筛选与双杂筛选的酵母cDNA文库，对酵母单杂交文库进行筛选得到一个与DRE互作的ERF转录因子StERF5，该转录因子属于典型的AP2/ERF转录因子家族。以马铃薯品种“紫花白”为材料，扩增获得了马铃薯转录因子StERF5基因。测序结果表明，该基因全长1240 bp，其中100-163为AP2保守结构域，属于EREBP亚族中ERF类成员。构建了StERF5酵母双杂交载体，将诱饵载体pGBKT7-StERF5与马铃薯干旱胁迫下的酵母文库cDNA杂交融合/共转化，经筛选和检测得到3个与马铃薯StERF5互作的蛋白，分别为组蛋白H2B、特异性蛋白磷酸酶、R3H型单链核酸结合蛋白，GO分析表明其对马铃薯响应干旱的信号代谢通路具有一定的调控作用。本项目取得的结果对于后续解析ERF和其互作蛋白共同调控马铃薯抗旱性的机理、改良马铃薯的抗旱性具有一定的理论和应用价值。