益肾颗粒调控足细胞自噬作用改善糖尿病肾小球硬化症的作用机制研究

Diabetic nephropathy (diabetic nephropathy, DN) is one of the major microvascular complications of diabetes and the leading cause of end-stage renal failure and Hemodialysis. Podocyte autophagy dysfunction caused by mTOR/P13k/Akt and AMPK-Sirt1 related nutritional sensing pathway (Nutrient-sensing pathways) under high glucose status is the key cause of DN, which is the new target for prevention and treatment of DN. Based on your clinical and experimental study, in the project, by using the mTOR/P13k/Akt and AMPK-Sirt1 as entry point, a type 2 diabetes model was developed with DBA/2J induced by high glucose and STZ. With this model and in vitro induced Podocyte, the prevention and control mechanism of DN by kidney particle regulated podocyte autophagy is investigated.

糖尿病肾病 ( diabetic nephropathy，DN ) 是糖尿病主要的微血管并发症之一,是导致患者终末期肾衰和进入血液透析的首要病因。高糖状态下mTOR/P13k/Akt和AMPK-Sirt1等营养感应通路（Nutrient-sensing pathways）的变化引起的足细胞自噬障碍是DN发病的关键环节，也是防治DN的新靶点。本课题组拟在前期临床和实验研究基础上，以营养感应通路——mTOR/P13k/Akt和AMPK-Sirt1通路调控足细胞自噬为切入点；选用DBA/2J近交系小鼠，采用高糖高脂饮食+STZ诱导方式构建2型糖尿病肾病动物模型；以DBA/2J近交系DN小鼠模型及体外高能环境下培养的永生化足细胞为研究对象，从能量代谢——足细胞自噬的角度深入探讨中药益肾颗粒防治肾小球硬化、改善糖尿病肾病的的作用机制。

糖尿病肾病 ( diabetic nephropathy，DN ) 是糖尿病主要的微血管并发症之一,是导致患者终末期肾衰和进入血液透析的首要病因。高糖状态下营养感应通路的变化引起的足细胞自噬障碍是DN发病的关键环节，也是防治DN的新靶点。本研究通过体内和体外实验，以营养感应通路P13k/Akt/ mTOR和LKB1/AMPK/Sirt1调控足细胞自噬为切入点；以糖尿病肾病模型，和高糖诱导的足细胞损伤模型为研究对象，从能量代谢：足细胞自噬的角度深入探讨了中药益肾颗粒防治肾小球硬化的作用机制。体内实验：雄性Wistar大鼠105只，随机取10只为正常组，常规饲料饮食；其余95只采用高糖高脂饲料喂养联合STZ小剂量（30mg/kg）腹腔注射法诱导糖尿病肾病大鼠模型，将造模成功后的大鼠随机分为模型组，中药组（中药低剂量、中剂量、高剂量组）、西药组（二甲双胍组、缬沙坦组），每组均15只。灌胃10周后处死，收集血液，检测肾功能、血脂、血糖，光镜及电镜下观察肾脏组织病理改变。Western blot检测P13k/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/Sirt1信号通路相关蛋白。结果发现益肾颗粒能够降低糖尿病肾病大鼠Scr、BUN、FBG、TG、TC、24U-TP ，减轻肾组织病理损伤，下调P13k/Akt/mTOR和上调LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，增加自噬，这可能是其减缓肾小球纤维化的作用机制。体外实验：通过高糖诱导足细胞损伤模型，CCK8法及Western blot筛选出35mmol/L高糖浓度刺激48小时为高糖模型组，10%含药血清为最佳中药干预浓度。用Western blot法检测足细胞相关蛋白Nephrin、podocin及自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1、P62的表达量。MDC、Lyso-tracker、DAPI染色观察足细胞自噬的改变。并在含药血清干预足细胞的同时分别予以自噬抑制剂、自噬诱导剂、AMPK抑制剂、LKB1抑制剂干预，Western blot检测自噬及通路相关蛋白的表达情况。结果发现益肾颗粒含药血清可以下调P13k/Akt/mTOR和上调LKB1/AMPK/Sirt1信号通路，增加自噬，这可能是益肾颗粒减轻足细胞损伤的作用机制。本项研究更好的阐述了益肾颗粒的作用机制，为该方的临床应用及推广提供基础。