循环肿瘤细胞的捕获与能量代谢分析一体化微流控系统的研制

We propose a metabolic profiling tool for selecting more aggressive and invasive circulating tumor cells (CTCs). CTCs are cells that have shed into the vasculature from a primary tumor and circulate in the bloodstream, which is essential for establishing metastasis, a mechanism that is responsible for the vast majority of cancer-related deaths. CTCs are used as an important real-time “liquid biopsy” biomarker for non-invasive monitoring the progress of cancer and for evaluating the cancer treatment. Recently, there are increasing demands beyond the enumeration of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) positive CTCs from both basic research and clinical trials. CTCs undergone epithelial-mesenchymal transition (EMT) are more aggressive, invasive and show resistance to chemoradiotherapy. Mesenchymal phenotypic CTCs are coupled with metabolic reprograming. They predominantly rely on aerobic glycolysis, producing energy by a high rate of glycolysis followed by lactic acid fermentation in the cytosol, a phenomenon termed “Warburg effect”. We propose a microfluidic platform consisted of immunomagnetic nanoparticles, a soft magnet array and a sub-nanoliter reactor array for capturing multi-phenotypic CTCs and performing metabolic profiling on each of single CTCs or CTC clusters. The selected metabotypic CTCs can be subjected to multi-parameter studies, including genomics, transcriptomics and proteomics in the future. We expect the improved understanding of metabolic reprograming of CTCs may inform therapeutic strategies to impair metastasis, providing a powerful tool for personalized medicine and precision medicine.

本项目将发展一种在单细胞水平上研究能量代谢的工具，用于筛选更具恶性的循环肿瘤细胞。目前对外周血中分离出的上皮细胞粘附分子阳性的循环肿瘤细胞进行计数的方法已不能满足临床需求。肿瘤细胞会通过上皮-间质转变获得间质细胞的表型从而更具运动性和侵袭性，成为放化疗耐受和肿瘤转移的重要因素。上皮-间质转变往往还伴随着代谢重编程。越来越多的证据表明代谢重编程不只是以前普遍认为的基因表达改变的伴随结果，而是在肿瘤转移过程中起着关键作用。我们将建立以免疫磁珠法为基础，以微流控系统为平台的循环肿瘤细胞捕获系统，建立亚纳升级的微反应器阵列实现对单细胞的能量代谢分析，筛选更具恶性的循环肿瘤细胞，以进一步对代谢重编程在系统水平上进行基因组、转录组和蛋白组等多参数协同研究。本课题将为基于阻断能量代谢途径而阻断肿瘤细胞快速增殖的新型肿瘤治疗策略提供基础，有望为肿瘤的个体化医疗提供更为精准的诊断工具。

肿瘤细胞会通过上皮-间质转变获得间质细胞的表型从而更具运动性和侵袭性， 成为放化疗耐受和肿瘤转移的重要因素。上皮-间质转变往往还伴随着代谢重编程。越来越多的证据表明代谢重编程不只是以前普遍认为的基因表达改变的伴随结果，而是在肿瘤转移过程中起着关键作用。为突破目前对外周血中分离出的上皮细胞粘附分子阳性的循环肿瘤细胞进行计数的方法的局限性，实现对循环肿瘤细胞进行能量代谢检测，我们主要从三个方面展开研究工作： (1) 按照循环肿瘤细胞的捕获、释放、能量代谢和下游基因分析的需求，研究了一系列相关的微流控芯片，并考虑到未来一体化集成分析芯片的可能。优化微磁铁阵列设计，采用中心位置偏移的蜂窝状结构设计和多级设计，实现最优的捕获效率和纯度分别为88±9%和90%±6%。 (2) 针对能量代谢及下游分析对设备的需求，搭建了能量代谢分析系统和单细胞或单细胞簇释放系统。能量代谢分析系统配合微流控芯片，可以实现亚纳升级气密性微反应器，通过设计的气密性测试，用于氧消耗速率(OCR)和细胞外酸化速率(ECAR)等主要能量代谢指标的检测。为实现对单细胞或单细胞簇的下游贯穿组学分析，在荧光显微镜的基础上结合了数字微镜装置，实现了对紫外敏感手臂分子的定点光切割和循环肿瘤细胞释放。 (3) 利用多色敏感膜，对捕获细胞进行了OCR和ECAR等主要能量代谢指标的检测，并用羰基氰酯-3-氯苯基腙(CCCP)对细胞作用后，检测到氧消耗速率大大增加; 用鱼滕精对细胞作用后，检测氧气消耗速率减慢; 验证了细胞在药物刺激后的能量代谢变化特征。单能量代谢研究还依赖于进一步的大量统计计算，相关的结果还在整理过程中。我们期望尽快将项目发展的研究平台应用于实际临床样品的研究。