以异种骨基质微载体和基因修饰的人脂肪干细胞三维动态培养构建大尺寸组织工程骨

Large size tissue-engineered bone construction is still restricted by factors like seed cell phenotypic instability, osteoinduction and bone conduction inefficiency of scaffold material, maldistribution of seed cells inside the construct, necrocytosis and apoptosis due to limited mass transfer. In this study, we use heterogenous antigen-extracted bone matrix particles as microcarriers to amplify TERT and BMP-2 gene modified human adipose-derived stem cells under simulated microgravity condition, and the heterogenous antigen-extracted bone matrix from porcine cancellous bone is prepared by a new method, namely defatting by supercritical CO2 fluid extraction, deproteinization by ultrasonic cleaning with enzyme and hydrogen peroxide solution, and then surface modification by polylysines. First we construct small size tissue-engineered bone (microfabricated tissues), and then put the microfabricated tissues into continuous perfusion culture bioreactor to form large size designated shaped tissue-engineered bone construct. We aim to provide a novel method to resolve the problem of maldistribution of seed cells and limitation of mass transfer in conventional tissue-engineered bone construction,and to explain the related mechanism.

工程化构建大尺寸骨组织的研究目前仍受到诸如种子细胞表型不稳定、支架材料骨诱导/传导能力不强以及大尺寸构建物内部种子细胞分布不均和传质受限而导致的细胞坏死和凋亡等现状的制约。本研究将TERT基因和BMP-2基因修饰的人源ADSCs作为种子细胞，超临界CO2萃取脱脂结合酶/双氧水超声清洗脱蛋白制备的，经多聚赖氨酸进行表面改性的猪去抗原松质骨基质微粒作为微载体，对模拟微重力环境下规模化扩增种子细胞的可行性进行探索性研究。在此基础上，分两步走，首先在旋转壁式生物反应器内构建出小尺寸的工程化骨组织（微构组织），然后利用微构组织聚团特性，在连续灌注培养生物反应器内构建大尺寸可塑形的组织工程骨，探索骨组织工程研究新的构建方法及其机制，解决骨组织工程传统构建方法造成的种子细胞在支架材料上分布不均和传质制约问题。

工程化构建大尺寸骨组织的研究目前仍受到诸如种子细胞表型不稳定、支架材料骨诱导/传导能力不强、大尺寸构建物内部种子细胞分布不均和传质受限而导致细胞坏死和凋亡等现状的制约。. 本研究将将TERT基因和BMP-2基因共同转染人ADSCs，但结果并不理想，因此改用局部缓释BMP-2方法，我们把带有胶原结合域的BMP-2（CBD-BMP-2）与有序胶原丝结合，获得了具有明显BMP-2缓释功能的分化调控单元。在去抗原松质骨基质微粒构建方面，我们做了大量工作，但处理工艺不能达到商品化骨的程度，且其细胞粘附较差，因此我们用cultispher-s明胶微球作为微载体接种鼠BMSCs构成细胞单元，将上述2个单元在连续灌注培养反应器内培养成功获得厘米级的生物仿生骨组织，并具有一定力学强度。大鼠体内实验结果显示形成骨样组织，质地硬，切开后中心无坏死，各项检测提示体内结果明显优于体外实验结果。. 种子细胞扩增方面，我们利用三维胶原多孔支架材料结合旋转细胞培养器创建了一套三维立体动态培养环境下的种子细胞扩增系统，结果显示该系统促进了种子干细胞的增殖并维持了其分化潜能。. 我们的研究利用组织微构技术初步解决了组织工程骨构建过程中种子细胞分布不均匀的难点，利用三维动态培养系统扩增种子细胞并维持其分化潜能在组织工程乃至再生医学领域均有较为重要的应用价值，成功构建的组织工程骨有较好的临床应用前景。