早期死亡时间推断敏感性mRNA指标的鉴定与功能学研究

The accuracy of postmortem interval (PMI) estimation is the most important and difficult issues in forensic practice. Current research results were came from some house-keeping genes by using quantitative analysis of RNA detected by qRT-PCR, but can only work on later PMI. Because these markers has not been systematically chosen, no remarkable relationship with early PMI (EPMI, within 24 hours) can be used. Therefore, it is necessary to find the mRNA markers which have better correlation with PMI for accurately EPMI estimation..In this study, high throughput mRNA microarray will be used to analyze human and SD rats’ tissues with different postmortem interval in order to find the sensitive mRNA markers for EPMI estimation. Series of appropriate markers will be found after verification of the SD rats and human samples using qRT-PCR..Moreover, the relationship between these mRNA markers and the phenomenon of hypoxic-ischemic, energy alternation and cell apoptosis will be analyzed and verified. The biological function, mechanism and the signal path-way these mRNA participate in will also be analyzed through bioinformatics databases. This project will provide theory basis in choosing these mRNA markers for EPMI estimation, may provide helps to solve forensic practice cases more accurately and quickly.

死亡时间（Postmortem Interval，PMI）推断是法医学实践中的重点和难点。现有的PMI推断研究成果多集中在晚期PMI推断，且仅涉及一些管家基因，对于死后24小时以内的早期死亡时间（Early Postmortem Interval，EPMI）推断存在指标选择单一的缺陷，缺乏敏感的、特异性的指标。本项目在前期预实验的基础上提出了以下研究计划：1.采用高通量的mRNA表达谱芯片技术，检测SD大鼠和人体样本，通过筛选、qRT-PCR验证，获得在EPMI内敏感变化的mRNA指标。2.通过生物信息学分析，获得这些mRNA指标所在的相关信号通路，并研究其表达变化的机制，阐明死后早期缺血缺氧、能量交换和细胞死亡等调控因素对mRNA在EPMI内变化规律的影响，为寻找特异性的EPMI敏感性mRNA指标提供理论依据，有助于法医学实践中案件的快速侦破。

准确推断死亡时间（Postmortem Interval，PMI）是法医学实践中的重点和难点。随着实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）技术和测序技术的发展，mRNA相对定量成为可能并被用于PMI推断。现有的相关研究多集中于通过高丰度管家基因的降解水平推断晚期PMI，而对于死后24小时以内的早期死亡时间（Early Postmortem Interval，EPMI）推断则缺乏高精度、高特异性的指标。.研究发现，部分基因在死亡早期表达上调，通过基因表达谱芯片筛选出差异表达的基因，经qPCR扩大样本实验（多温度组4℃、15℃、25℃、35℃）寻找合适指标并构建温度、PMI及ΔCt相关的三元方程，有望减少温度对PMI推断的干扰，并弥补现有EPMI推断指标的不足。.本课题研究成果如下：（1）确定心肌、脑组织为利用基因转录水平推断EPMI的良好检材，而骨骼肌不适合用于EPMI推断；（2）在进行qPCR实验时，必须经内参标准化。实验结果显示，Rpl27是心肌最适内参，5SrRNA是脑组织及骨骼肌最适内参；（3）对表达谱芯片检测结果进行Fc差异比较分析、Cluster聚类分析和Go及Pathway分析，对初筛基因经扩大样本实验验证后，最终确定5个适用于EPMI推断的指标：心肌Cdc25b，脑组织Ninj2、Grifin、Hopx及Arpp19；（4）通过R软件对上述指标建立温度（T）、PMI及ΔCt相关的三元方程，并构建多组织、多指标的EPMI推断体系。.通过MATLAB将方程转化为三维可视图形，使各指标的变化水平清晰明了。.（5）经大鼠实验验证，心肌Cdc25b的误差可控制在2.5h内，脑组织Ninj2、Grifin、Hopx及Arpp19的误差可分别控制在1.5h，2.7h，1.8h及2.5h内。将2种组织5个指标分别推得的死亡时间取平均值，将有效减少误差，控制死亡时间推断误差在1.5h内；（6）目前共搜集到EPMI人体样本12例，动物实验所建方程应用于人体的误差较大，但方差较小，需继续搜集人体样本，构建上述指标适用于人体的EPMI推断方程。