基于微纳光学结构阵列的超分辨扫描荧光生物成像

The resolution capability of conventional optical microscopes is limited by the so-called diffraction limit and they can resolve features of around half of the wavelength of illumination. The realization of super-resolution imaging is dependent on pursuing the method to overcome the diffraction limit and studying the mechanism. We previously presented the use of microlens in combination with a conventional optical microscope to image sub-diffractional-limited nano-objects, providing a robust and affordable tool for super-resolution optical microscopy. The microlens generated a photonic nanojet, which directly correlated with the super-resolution capability of the imaging system. Here, we propose to develop a scanning super-resolution instrument for fast imaging of fluorescent biological samples with a large field-of-view. A micro-fabricated array of ordered micro-/nano-structures is used to scan over the sample by using a customized algorithm that moves step-by-step, in the meanwhile, the camera mounted on the microscope takes pictures at every step and the images from each micro-/nano-structure with super-resolution are stitched together into a mosaic image. In this project, the principle of micro-/nano-optical structures generating photonic nanojets will be presented, the super-resolution imaging system based on the photonic nanojet array will be developed, and the real-time observation of sub-diffraction-limited sample will be achieved by using scanning microscopy technique, therefore the functions of sub-cellular structures and the signal transmission between cells will be studied. The completion of this project will not only improve the theoretical study of this technique, it will also generate a low-cost super-resolution imaging method. These studies will improve the development and engineering of photonic nanojet-based super-resolution imaging, they will also provide new strategies on imaging and research on sub-diffraction-limited objects.

光学衍射极限是限制显微系统分辨率的主要原因。深入研究突破衍射极限的机制与方法，是实现超分辨成像技术的迫切需求。申请人前期在常规光学显微镜中结合微透镜以产生光子纳米喷流(photonic nanojet)，可实现对亚衍射极限的纳米结构的超分辨成像，具备光学系统功能强大而相对价格低廉的独特优势。本项目拟开发以光子纳米喷流阵列为基础的扫描式超分辨显微技术，针对生物样品进行快速、宽视场的荧光成像：项目拟以微纳光学结构产生光子纳米喷流效应的原理研究为基础；以构建基于光子纳米喷流阵列的超分辨成像装置为主线；通过阵列扫描方式实现针对亚衍射极限的待测样品的宽视场观测与追踪，从而研究亚细胞结构功能与细胞信号传递过程。本项目的完成不仅完善了这一成像方法的理论研究，并且实现了快速、宽场的超分辨成像系统，这些研究将扎实推动光子纳米喷流超分辨成像的学术发展和工程化，将为亚衍射极限纳米结构的成像识别与研究提供新策略。

开发以光子纳米喷流阵列为基础的扫描式超分辨显微技术，针对生物样品进行快速、宽视场的荧光成像，能够为生物样本的检测与研究提供一种简单、快速、直接且可靠的方式。本项目从三个层面深入研究了基于光子纳米喷流效应的超分辨成像与超灵敏检测技术：.1.理论层面，系统研究了光子纳米喷流的产生机理，发现当照射光分别通过微粒入射界面的边缘或中间部分时，光会在微粒出射界面的后部分别形成快速或缓慢两种不同的会聚-发散模式。通过对函数曲线的对数化和微分运算，得出界定入射界面边缘和中间区域的边界点，即“拐点”的位置；并分析了光照射微粒入射界面中间区域形成长的光子纳米喷流和照射边缘区域形成短的近场聚焦等特征光场，提出了一种调制光子纳米喷流的新方法。上述理论研究为建立新型超灵敏光学检测方法提供了设计指导及参数选择理论。.2.技术层面，提出了利用模板辅助自组装方法制备大规模光子纳米喷流阵列。首先制作了二维大尺寸微阱阵列模板，并利用尺寸均匀性好的微球在模板上形成微透镜阵列，汇聚入射光并产生大规模的光子纳米喷流阵列。这一方法实现了一种简单、可靠、快速的方法来制造大规模均匀化的光子纳米喷流阵列，为后续应用提供了技术平台。此外，实现了大规模微透镜阵列与光学显微镜的有机结合，搭建了基于普通荧光显微镜的扫描式超分辨成像装置。深入开展对生物样本进行研究的光学检测平台，需要针对痕量组分检测的响应时间要求高的问题，提出新颖方案。项目执行期内，项目团队通过微流控芯片技术实现被测流体的精确操控，系统研究了片上样品制备的技术方法，为样本的精准检测提供了技术支撑。.3.应用层面，针对研究的亚细胞结构，包括外泌体等，开发了高效的样本处理方法、以及荧光标记与表征方法，并利用上述超分辨成像装置，实现了高效的信号放大和生物物质检测。由于介电微球透镜可以通过光子纳米喷流将光压缩到亚波长尺度，使得光被限制和集中到一个非常小的区域中，位于光子纳米喷流焦点区域的目标物会被激发出强烈的光-物质相互作用，实现超分辨成像和超灵敏生物传感。.综上所述，在项目资助下，在上述三个层面都取得了成果。项目执行期内，项目负责人作为通讯作者共计发表SCI文章11篇，EI论文7篇；合著英文专著1部；同时申请发明专利7项，已授权1项。