PCV2 Rep 蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制及致病性的影响

Porcine circovirus type 2 contains three major open reading frames (ORFs). ORF1 encodes the replication protein(Rep),involved in virus replication and ORF2 encodes the capsid protein (Cap)associated with immunogenicity and ORF3 encodes non-structural proteins related to apoptosis.The Rep protein contains three N-sugar glycosylation sites. Glycosylation as a major post-translational modification of protein function has an important influence, for example, glycosylation plays an important role in virus life cycle.There were Cap protein N-glycosylation site mutation reported about PCV2 DNA vaccine immunogenicity, but the role of Rep protein N-glycosylation sites mutations in the viral replication and pathogenicity have not been reported. In this study,we want to acquire single point by point mutation, two and three-point mutations, mutations in different sugar glycosylation sites of PCV2 full-length infectious clone of PCV2, after rescue of mutant viruses ,the rescued mutant viruses were then inoculated PK-15 cells (in vitro) to study the mutant virus replication in vitro and inoculated BALB / c mice (in vivo), studies of viral replication and pathogenicity change. This study could clarify the role of mutations on the Rep protein N-glycosylation sites between viral replication and pathogenicity, and could offer reference for further clarify the PCV2 replication and pathogenesis.

猪圆环病毒2型主要有与病毒复制相关的Rep蛋白，与免疫原性相关的Cap蛋白及ORF3编码的与细胞凋亡相关的非结构蛋白三种蛋白，其中Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起着重要的作用。目前有Cap蛋白N-糖基化位点突变对PCV2核酸疫苗免疫原性影响的报道，但Rep蛋白N-糖基化位点突变在病毒复制及致病性中的作用如何未见报道。本研究拟在PCV2感染性克隆的基础上，通过点突变的方法对其进行单点、两点和三点突变，获得不同糖基化位点突变的PCV2全长感染性克隆。在体外拯救突变病毒的基础上，进行接种PK-15细胞（体外），研究突变病毒的复制性；接种BALB/c小鼠（体内），研究病毒的复制性及致病性是否发生改变。明确Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制和致病性的影响，为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。

猪圆环病毒2 型主要有与病毒复制相关的Rep 蛋白，与免疫原性相关的Cap 蛋白及ORF3 编码的与细胞凋亡相关的非结构蛋白三种蛋白，其中Rep 蛋白含有三个潜在的N-糖基化位点。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响，例如糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起着重要的作用。关于PCV2 Cap 蛋白糖基化位点的作用目前只有Gu等报道将PCV2 Cap蛋白上潜在的糖基化位点143-145aa (NYS)由天冬酰胺（N）突变为天冬氨酸（D），将Cap蛋白突变后的PCV2核酸疫苗免疫BALB/c小鼠，增强了DNA疫苗的小鼠体内的特异性反应的报道，但Rep 蛋白N-糖基化位点突变在病毒复制及致病性中的作用如何未见报道。. 为明确Rep 蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制和致病性的影响，本研究在前期实验室构建好的PCV2感染性克隆的基础上，获得三个单点突变和一个未突变的双拷贝PCV2全长感染性克隆，分别命名为2M23、2M256、2M286、2PCV2，接种无PCV污染的PK-15细胞，体外拯救突变体病毒。对拯救成功的病毒进行病毒生长曲线及病毒复制性和致病性影响检测。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果，TCID50测定病毒的感染力，荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示，PCV2 Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的体外复制能力而286～288aa突变后增强病毒的体外复制能力。结果发表在《Veterinary Microbiology》上，阐明了Rep 蛋白N-糖基化位点突变对病毒体外复制的影响。. 为深入了解PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制和致病性的影响，在实验室前期构建好的平台上，用2M23、2M256、2M286和2PCV2拯救病毒株分别对BALB/c小鼠进行攻毒实验，进行抗体、病毒含量和免疫组织化学等的检测。结果显示，拯救突变病毒和未突变病毒均能在BALB/c小鼠体内进行复制，且具有致病性。. 通过本项目研究明确了PCV2 Rep蛋白23～25aa、256～258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的体外复制能力而286～288aa突变后增强病毒的体外复制能力，为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供了参考。