SETD2通过lnc-ANRIL调控细胞衰老抑制肾透明细胞癌发生的作用及机制的研究

Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is one of the most lethal urologic cancers. In recent years, abundant evidence shows SETD2 loss fuels the progression of ccRCC, but with a vague understanding of its role in tumorigenesis. Cellular senescence is a known tumor suppressive mechanism dominantly happened at tumor initiation. In this study, we will use lentivirus mediated shRNA knockdown of SETD2 in Primary Tubular Epithelial Cells (PTECs), the precursors of ccRCC, to mimic its biallelic inactivation at the very beginning of tumor initiation. We will investigate the changes of PTECs after SETD2 loss in senescence associated phenotypes, expression signatures and signaling pathways, as well the tumorigenicity of the cells; then screen for SETD2 determined senescence-associated mRNA and lncRNA by using RNA-sequencing, and clarify the role of SETD2—lnc-ANRIL axis in establishing senescence barrier by simultaneous knockdown of SETD2 and lnc-ANRIL in PTECs. Our study will give insight into the role of SETD2 loss as the driving force of ccRCC initiation, and the result will shed light on early diagnosis and screening new drug targets for SETD2 mutated ccRCC patients.

肾透明细胞癌(ccRCC)是最常见的、恶性程度最高的肾癌亚型。以往的研究表明抑癌基因SETD2失活促进ccRCC进展，但是否驱动肿瘤发生并不清楚。细胞衰老是肿瘤发病早期重要的抑癌机制。本课题将在ccRCC前体细胞—原代肾小管上皮细胞(PTECs)中，通过慢病毒介导的shRNA敲减SETD2模拟肿瘤发病阶段SETD2的失活，观察细胞衰老相关表型、分子标记、信号通路的变化，以及SETD2敲减后PTECs的成瘤性，探讨SETD2失活对ccRCC的驱动作用；通过RNA测序筛选出受SETD2调控的参与PTECs衰老的mRNA和lncRNA，并通过双敲减实验明确SETD2—lnc-ANRIL轴对PTECs细胞衰老的分子调控机制。通过本项目的实施，我们将明确SETD2失活对ccRCC发生的驱动作用，为其早期诊断和设计新的靶向药物提供线索和依据。

位于3p的SETD2在多种肿瘤中发生突变，其编码的蛋白产物负责H3K36me3修饰，对于维持基因组的稳定性和高保真性至关重要。在肾透明细胞癌(ccRCC)及非小细胞肺癌(NSCLC)中，3p缺失普遍存在，提示SETD2的双等位基因失活可能在疾病的发生发展过程中发挥关键作用。我们首先分离、培养并鉴定了ccRCC的前体细胞（肾小管上皮细胞，PTECs)，通过shRNA敲减(KD)SETD2后研究了PTECs表型及转录组变化。生长竞争实验表明，SETD2-KD与SETD2-WT PTECs共培养时表现出竞争优势；SETD2-WT PTECs培养至第5代不再增殖且β-gal染色阳性，而SETD2-KD PTECs在培养第七代时仍保持增殖且β-gal染色阴性，表现为衰老障碍。RNA-seq分析发现，SETD2缺失抑制了调控细胞衰老的P16-RB1通路，使PTECs无法建立衰老屏障。随后，我们构建了SETD2敲除(KO) NSCLC A549细胞系。CCK8实验和生长竞争实验表明，SETD2-KO A549细胞活性降低，增殖减慢；细胞周期和凋亡实验表明，SETD2-KO A549细胞中，发生S期阻滞和晚期凋亡的比例增高。RNA-seq分析发现，EMT、血管生成及细胞凋亡相关的基因在SETD2-KO A549细胞中富集，VCAN是EMT和血管生成基因集共有的引领基因。蛋白质谱分析发现， SETD2-KO A549细胞中表达变化的蛋白主要参与细胞移动及迁移的调控。免疫荧光实验表明，SETD2-KO A549细胞胞浆中VCAN明显增高。这些结果提示，SETD2失活能够上调VCAN降低A549细胞的粘附能力，促进肿瘤细胞转移；体外细胞粘附实验及移动实验也证实了该结论。随后，我们在CDX小鼠中进行验证，发现接种SETD2-KO A549细胞的NOD/SCID裸鼠在1周后成瘤，但活体成像信号在35天时基本消失；接种SETD2-WT A549的裸鼠只是信号范围略有缩小。小鼠处死后，我们在脾脏发现了大量核深染异型细胞，提示可能是转移而来的A549细胞。最后，我们分析了我院145例NSCLC患者的的临床数据，发现SETD2突变患者的肿瘤负荷较高；分析TCGA数据库中RCC和NSCLC患者的临床数据，我们发现RCC及NSCLC患者的总生存与SETD2表达水平负相关，与VCAN水平正相关。综上所述，