家白蚁肠道共生原虫降解纤维素酶基因的克隆与表达

白蚁是自然界中纤维素高效利用的体系之一，在木质纤维素的生物循环中发挥着重要的作用。低等白蚁（家白蚁是其中一种）体内共生的大量原虫具有吞噬木质颗粒的能力，并产生丰富的纤维素酶，可以帮助白蚁分解和消化食物中的纤维素成分，使其转变为可吸收利用的营养物质。随着不可再生化石资源的减少，大量可再生的木质纤维素类生物质成为替代化石能源的最佳选择。而纤维素降解酶的效率，限制了我们对生物质能源的充分利用。对纤维素具有高效降解作用的白蚁肠道内原虫为我们挖掘新型纤维素酶基因提供新的思路和途径。本课题将以发掘白蚁后肠共生原虫纤维素酶基因资源，获得多个表达纤维素酶的相关功能基因，在此基础上进行体外表达和改造，以期开发出高效降解纤维素的酶类为目标。同时，期望进一步解释原虫和其宿主白蚁协同消化食物的机理，探讨原生动物与其宿主的共生关系。本项目在基础研究和在国家需求方面都具有一定的意义。

随着化石燃料的不断消耗，寻求新的可再生能源成为世界各国高度关注的问题。纤维素作为地球上最丰富的可再生资源越来越受到人们的高度重视。现阶段，阻碍我们对生物质资源充分利用的关键问题是纤维素的降解效率不足。白蚁是自然界中高效利用纤维素的系统之一，是一个小型的纤维素降解反应器。家白蚁体内共生着大量的原虫，这些原虫具有吞噬木材颗粒的能力。原虫能产生丰富的纤维素酶，帮助白蚁分解食物中的纤维素成分，使其转变为可利用的营养物质。解析白蚁肠道原虫纤维素降解体系是获得新型纤维素水解酶的有效途径。.对白蚁肠道原虫种类和数量的研究是解析这个微生物群落功能的基础。通过形态特征和分子生态学方法对原虫群落的组成进行了调查。光学显微镜和扫描电子显微镜观察鉴定了家白蚁肠道内的3种原虫，分别为伪披发虫Pseudotrichonympha grassii、全鞭毛虫Holomastigotoides mirabile和旋披发虫Spirotrichonympha leidyi。对18S rDNA文库限制性片段长度多态性的分析获得了四种18S rDNA序列，伪披发虫、旋披发虫各一种，全鞭毛虫两种。原虫细胞计数结果显示，工蚁肠道内平均含伪披发虫780±179头，全鞭毛虫1630±391头，旋披发虫2950±1003头。.为了获取原虫参与木质纤维素降解的功能基因，构建了全长cDNA表达文库并通过对原虫群落元转录组的454焦磷酸测序，获得了80.3 Mbp的序列。KEGG注释揭示元转录中与吞噬作用、细胞骨架动态平衡和糖代谢相关通路是优势通路。在元转录组中发现了155个与木质纤维素降解相关的基因，其中包括118个糖基水解酶（Glycosyl hydrolase），6个糖基转移酶（Glycosyl transferase），5个糖酯酶（Carbohydrate esterase），4个多聚糖裂解酶（Polysaccharide lyases），10个糖基结合元件（Carbohydrate-binding module）和其它12个糖活性蛋白（Carbohydrate active protein）。随后选择了一个高表达的原虫糖基水解酶作为研究对象，对其酶活性质进行了研究。结果表明该基因编码一个GHF10家族的木聚糖酶。该酶最适pH为6.0，最适温度为50 °C。该酶是首个从家白蚁肠道原虫中获得的GHF10家族木聚糖酶，