C9orf72基因突变导致ALS/FTD神经退行性疾病的机制研究

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease, affecting both lower and upper motor neurons. The hexanucleotide GGGGCC repeat expansion in non-coding region of C9orf72 gene is the most frequent genetic cause of ALS. However, the pathological mechanisms of C9orf72 hexanucleotide expansion remain unclear. In this project, we take advantage of C9orf72-3*Flag knock-in mice to identify DNA-PKcs as a novel binding protein of C9orf72 by IP-MASS. DNA-PKcs is critical kinase for NHEJ repair pathway activation after DNA double-strand breaks induction. Activation of DNA repair pathway and NHEJ efficiency were significantly impaired in C9orf72-deficient neurons. Therefore, we propose that both gain of function and loss of function mechanisms may contribute to neurodegeneration through DNA damage induction and impairment of damage repair respectively. Finally, we will determine whether NHEJ repair is critical for neurodegeneration by deleting LIG4 gene in mature neurons. Our study will gain a better understanding of how aging neurons with accumulated DNA double-strand breaks eventually become degeneration.

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是运动神经元退行性疾病，C9orf72基因非编码区的六核苷酸重复扩增是目前发现的最为常见的ALS/FTD的人类突变。但是C9orf72基因突变如何导致神经元发生退行的机制还需深入研究。本项目通过C9orf72-3*Flag基因敲入小鼠发现C9orf72蛋白可以结合DNA双链断裂修复中关键分子DNA-PKcs，并且C9orf72调控神经元中DNA双链断裂后修复通路的激活以及NHEJ修复途径的效率。通过建立小鼠的模型我们试图阐明C9orf72基因突变后DPR蛋白和C9orf72表达下降通过影响神经元中DNA损伤的产生和修复一起导致神经退行。最后我们试图在成熟神经元中敲除LIG4研究神经元中NHEJ修复途径缺失对于神经退行性疾病发生的作用。本项目的研究试图阐明DNA双链断裂在神经元中的积累可能是神经元从衰老走向退行的重要的原因。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）也叫渐冻症是一种严重的运动神经元退行性疾病，通常在3-5年的时间内导致病人运动异常、肌肉萎缩、瘫痪、呼吸衰竭和死亡。由于我们对于ALS的致病机制了解不够深入，目前该疾病缺乏有效的治疗方法。在ALS突变的基因中，C9orf72基因突变是最为常见的。目前研究认为C9orf72蛋白表达下降参与了运动神经元退行的过程中，但是C9orf72蛋白如何参与该过程还需要进一步研究。该项目试图通过生物化学的方法探寻C9orf72蛋白的新功能并探讨C9orf72突变导致神经退行的分子机制。我们发现C9orf72可以富集在DNA损伤处，并且通过结合DNA-PKcs促进DNA-PK复合物的形成。神经元中敲除C9orf72会抑制DNA损伤导致的DNA-PKcs的磷酸化激活以及连接酶Lig4的招募进而减弱了DNA损伤修复的过程。我们在构建的小鼠模型中发现了C9orf72敲除会加速二肽重复蛋白导致的神经退行，并且在神经元中观察到了神经元中DNA损伤的积累。对于神经元死亡机制的探究中，我们发现了C9orf72敲除会导致PARP-1的持续激活和PAR的产生，并且PARP-1的持续激活可能导致了神经元的死亡。我们还观察到C9orf72突变的小鼠中神经肌肉接头的结构和功能的异常，并且阐明了二肽重复蛋白可能通过影响Agrin的信号通路影响了神经肌肉接头的维持。在项目的资助下，我们在知名的学术期刊上发表了三篇论文，并且有一位博士研究生和两位硕士研究生获得了学位。