破解银杏体细胞胚发生发育屏障的生理及分子基础

The rapid vegetative propagation of fine characters varieties in Ginkgo biloba L. needs an efficient and mature system of somatic embryogenesis (SEs). However the SEs of Ginkgo at present researches only observed cotyledon phase and the isolated somatic embryo cultured on medium no further development and necrosed. It became a technique bottle-neck for excellent scale breeding trees and genetic transformation researches of in Ginkgo biloba L. The difficulties of establishing SEs system of Ginkgo were due to the low embryogenic competence, low SEs induction frequency of callus and this caused lacking of high quality studying materials for subsequent embryonic development researches. The aim of this study was to improve the ability of Ginkgo explants embryogenesis, maintain high embryonic callus, increasing induction frequency of SEs, enhancing SEs development competence, and at last to establish an efficiency and frequency SEs culture protocol. We hope to crack the somatic embryogenesis and development barriers of Ginkgo explants by plant growth regulator (PGRs), osmotic pressure regulation, etc. At same time, we will study the DNA methylation，plant hormones，flavonoids and reactive oxygen species (ROS) metabolism, and find key genes and study the gene expressions by transcriptional profiling and qRT-PCR technology analysis in SEs embryogenic and development phases. This study will contribute to understanding the mechanisms of physiological and molecular in somatic embryogenesis and development process, and provide a research and technical platform for rapid, large-scale breeding fine varieties, excellent characters of genetic transformation in Ginkgo trees.

银杏良种繁育需要高效、成熟的体细胞胚发生体系，目前银杏体胚研究只观察到子叶胚发生阶段，体胚成苗体系不完善，这成了银杏规模化繁育和基因遗传转化的技术瓶颈。究其原因是由于胚性愈伤组织发生频率低，导致后续体胚发育研究缺乏足够的、高质量的研究材料。本项目在前期研究基础上，以提高银杏胚性细胞、体胚发生能力，建立高效、高频率的体细胞发生发育技术体系为目标，通过激素、渗透压等调控，研究DNA甲基化、激素、黄酮、活性氧代谢水平在体胚发生过程中的作用，破解制约银杏体细胞胚发生、发育的生理及分子屏障，建立成熟的银杏体细胞胚胎发生发育体系。通过外植体、胚性细胞和非胚性细胞、体胚的转录组测序及分析，挖掘银杏体胚发生相关基因，通过qRT-PCR分析验证关键基因的表达模式，探讨银杏体胚发生发育的分子机制。通过本项目的实施可为银杏良种规模化繁育、遗传转化技术体系建立及银杏胚胎发育的调控提供研究和技术平台。

银杏是我国特有珍稀树种，体胚发生体系的建立对其生物学研究和快繁技术开发均具有重要意义。本项目针对银杏体胚发生过程中存在的胚性愈伤组织发生频率低、褐化严重等制约体胚发生的瓶颈问题，以胚乳和幼胚为外植体开展研究，建立了胚性愈伤组织和体细胞胚的培养体系，通过生理、细胞学观察、转录组测序等技术手段，解析了影响银杏体胚发生的生理及分子屏障。主要结果有：8月底-9月初的银杏胚乳、3-5mm的幼胚为最佳感受态时期, 其胚性愈伤组织诱导率达88.9%，体胚发生率达48.6%。通过切片和电镜观察到了子叶期的体细胞胚，是目前已报道的最成熟的银杏体细胞胚。研究发现（生长素+细胞分裂素）/ABA比值在胚性愈伤组织中高于非胚性和原胚，抗氧化酶活性增强，内含物、黄酮含量增加是体胚发生的必要条件。低浓度NaHS可促进银杏细胞抗氧化酶活性和抗坏血酸含量。高浓度NaHS可抑制细胞生长，但能诱导出圆球形的胚性细胞。0.5-1.0 mmol/L的多胺能促进银杏细胞生长，提高抗氧化能力。银杏白果内酯能够抑制细胞内脂质的积累。.4个阶段的转录组测序分析中，共鉴定出36517个基因和2550个新基因。在非胚性vs胚性愈伤组织之间有958个差异基因，741个上调，217个下调。在KEGG通路中，植物激素信号转导，苯丙烷类、黄酮类化合物、苯丙氨酸、谷胱甘肽、萜内酯代谢等生物合成的基因大量上调。生长素与茉莉酸合成酶的基因、转录因子bZIP、WOX、WUS等与体胚发生显著相关。GbWUS1基因在胚性愈伤组织、早期体细胞胚中高表达，而GbWOX2表达则相反，表明这2个基因在体胚发生过程中起重要的调控作用。激素、活性氧、苯丙烷（黄酮）及萜内酯代谢、褐化是银杏体胚发生的主要限制因素。.本研究为银杏体胚的规模化繁育、遗传转化、基因编辑、胚胎发育调控等研究和应用提供技术平台和参考，达到国际先进水平，具有重要的应用前景。