CsFUS3调控柑橘体细胞胚发生的上游互作基因鉴定及分子机理

To overcome the obstacle to somatic embryogenesis (SE) capability maintenance in citrus molecular breeding, the applicant has studied the mechanism of SE in the past years. Our previous study showed that CsFUS3 gene could promote SE and form somatic embryos in the recalcitrant callus which lost SE capability. The function of CsFUS3 in citrus was different from its homologs in models plants, implying that CsFUS3 may play an important role during SE in citrus. Based on our previous studies, promoter deletion analysis, yeast one-hybrid assay, dual luciferase assay system and in vitro electrophoretic mobility shift assays (EMSA) will be applied to identify for the potential upstream interactive genes and determine the exact functional binding site. Moreover, genetic transformation of the CsFUS3 upstream gene will be applied to validate its function during SE. Expected results of this project will unravel the regulatory mechanisms of CsFUS3 during SE in citrus, which could provide theoretical foundation for improving SE capability.

针对柑橘分子育种中存在的愈伤组织胚性能力易丧失的障碍，申请人多年来对柑橘体细胞胚发生（体胚发生）分子机理进行研究。前期研究发现CsFUS3具有使丧失胚性的柑橘愈伤组织恢复生胚的能力，CsFUS3与模式植物同源基因不同的功能暗示其可能在柑橘体胚发生调控网络中充当重要角色。本项目拟以该基因为突破口，通过启动子顺式元件预测及缺失分析、酵母单杂交、双荧光素酶系统和凝胶迁移实验等技术，鉴定CsFUS3上游互作基因及两者准确的功能结合位点，明确CsFUS3与上游基因互作机制；利用遗传转化验证上游互作基因在柑橘体胚发生中的功能，最终将进一步揭示CsFUS3调控柑橘体胚发生的分子机理。本项目前期基础扎实，其实施有望进一步明晰柑橘体胚发生调控网络，为愈伤组织体胚发生能力的维持和增强提供理论支持。

针对柑橘分子育种中存在愈伤组织体细胞胚发生（体胚发生）能力易丧失的障碍，本研究以体胚发生相关基因CsFUS3为切入点，旨在揭示其调控柑橘体胚发生的分子机制。主要研究结果如下：1. 克隆CsFUS3基因全长，该基因属于B3超家族基因。亚细胞定位分析表明CsFUS3定位于细胞核。转录激活实验说明CsFUS3的转录激活功能域在氨基酸的羧基端。表达分析表明CsFUS3基因表达水平与柑橘体胚发生能力呈正相关。2. 超量表达CsFUS3基因能使完全丧失胚性的柑橘愈伤组织恢复体胚发生能力，并且能够回复拟南芥同源基因AtFUS3突变体表型。超量表达CsFUS3基因可以提高柑橘体胚发生相关基因CsLEC1、CsL1L、CsABI3、CsABI5、CsAGL15、CsVAL1和CsBBM的表达，这可能是CsFUS3基因促进柑橘体胚发生的原因之一。3. 转录组分析表明超量表达CsFUS3能够影响到内源激素反应。外施ABA以及多效唑（GA抑制剂）证明ABA/GA比值对CsFUS3介导的体胚发生能力增强具有重要作用。4. 在柑橘甜橙和柚基因组中分别鉴定除了72个和69个B3家族基因成员，表达分析表明CsFUS3与其它16个B3超家族基因成员在柑橘体胚发生晚期可能发挥重要的功能。