鸡大肠杆菌pilA-ompA融合基因工程菌株的构建与免疫原性研究

大肠杆菌病是鸡的主要传染病之一，给养鸡业造成严重经济损失。预防接种是控制该病的有效手段，但目前在养鸡生产中广泛应用的鸡大肠杆菌疫苗存在严重缺陷和不足，主要表现为传统灭活菌苗受制苗菌株限制，血清型覆盖范围狭窄；亚单位疫苗主要从致病菌培养物中提取、纯化菌毛或外膜蛋白，操作程序烦杂，制苗成本太高。.本项目针对鸡大肠杆菌疫苗的缺陷和不足，根据1型菌毛和外膜蛋白不仅具有良好的免疫原性，而且不同的血清型菌株之间存在良好的交叉保护作用的特点，利用基因工程技术，构建表达鸡大肠杆菌pilA-ompA融合基因工程菌株；通过动物试验，检验重组蛋白的免疫原性，为进一步研制抵抗多种血清型的广谱的鸡大肠杆菌基因工程疫苗提供基因材料和理论依据。

鸡大肠杆菌病是威胁世界养鸡业的主要细菌病之一，引起巨大的经济损失。预防接种是该病的主要防治手段，但由于鸡大肠杆菌血清型众多、各菌株之间缺乏交叉保护，给疫苗研制带来困难。本项目根据1 型菌毛和外膜蛋白不仅具有良好的免疫原性，而且不同的血清型菌株之间存在良好的交叉保护作用的特点，利用基因工程技术，构建鸡大肠杆菌pilA-ompA融合基因工程菌株，通过动物实验，验证重组PILA-OMPA 融合蛋白的免疫原性，为研制抵抗多种血清型的广谱性鸡大肠杆菌基因工程疫苗提供基因材料和理论根据。. 根据 GenBank 公布的鸡大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA 基因和外膜蛋白ompA 基因序列，分别设计两对引物，以分离的致病性鸡大肠杆菌基因组DNA 为模板，经PCR特异性扩增pilA 基因和ompA 基因，基因片段大小分别为 549 bp 和1040bp，与参考菌株的核苷酸同源性分别为87.25%～98.36%和94.87％～99.90％。将扩增得到的两个基因分别定向克隆到pET-32a中，得到两个重组质粒pET-32a-pilA 和pET-32a-ompA，转化宿主菌BL21(DE3)，IPTG 诱导，SDS-PAGE 检测，表达产物分别在37KD和55KD 处出现特异性条带。将表达的重组菌毛和重组外膜蛋白分别制成基因工程疫苗，免疫接种雏鸡，攻毒试验和抗体水平测定结果显示，重组菌毛和重组外膜蛋白均具有很好的免疫原性。. 将已构建的重组质粒pET-32a-pilA 和pET-32a-ompA分别用Nco I 和EcoR I 双酶切，回收pilA基因片段与pET32a-ompA 片段。用T4 连接酶将pilA基因片段连接在pET32a-ompA的上游，构建原核表达质粒pET32a-pilA-ompA，转化宿主菌BL21(DE3)，IPTG诱导，SDS-PAGE检测，表达产物在72KD处出现特异性条带。应用构建的基因工程菌株BL21（pET-32a-pilA-ompA）表达产物制备基因工程疫苗，免疫接种雏鸡，攻毒试验结果显示，重组PilA-OmpA 融合蛋白具有很好的免疫原性。