应用合成生物学构建饲用核黄素大肠杆菌高产菌株

Riboflavin is one of 8 B vitamins, it is essential for animals. Riboflavin production has shifted from chemical synthesis to exclusive microbiological synthesis in less than 15 years,and bacillus subtilis and ashbya gossypii are the main industrial producers. In recent years, riboflavin production costs continue to rise in china,as our cost of production keeps increasing,such as agricultural products, chemical raw materiasl, wages and environmental protection. Therefore, the further improvement of riboflavin producing strains and reduction in fermentation production cost have become a pressing matter of the moment.In this project, riboflavin high producer strains will be created using synthetic biology, 26 genes responsible for de novo riboflavin biosynthesis in bacillus subtilis were structurally optimized and chemically synthesized,then we reconstitute the riboflavin biosynthetic pathway in Escherichia coli.Finally, in vitro directed molecular evolution by DNA shuffling will be used for optimization of the T7 RNA polemerase , riboflavin biosynthetic pathway and Escherichia coli global transcriptional factor. This project will lay the foundation for the application of synthetic biology in vitamin biomanufacturing.

核黄素是8种B族维生素成员之一，它为哺乳动物的必需营养物。在最近15年时间内，化学合成核黄素完全被微生物合成所替代，目前发酵工业上的主要生产菌株为枯草杆菌和棉囊阿舒氏酵母。近年来，国内农产品以及各种化工原材料价格不断上升，人力、环保等多种开支也在增加，造成核黄素生产成本不断上升。因此，进一步改良核黄素生产菌种，降低发酵生产成本已成当务之急。本项目率先使用合成生物学技术构建高产核黄素的大肠杆菌工程菌株,对枯草杆菌核黄素从头生物合成途径的26个基因进行结构优化和化学合成，在大肠杆菌中重构核黄素生物合成系统。最终，将通过DNA重排技术对T7 RNA聚合酶、核黄素从头生物合成系统和全局转录调控因子进行体外定向分子进化，获得超量生产核黄素的大肠杆菌工程菌株。本项目将为合成生物学在维生素生物制造上的应用奠定基础。

近年来，国内农产品以及各种化工原材料价格明显上涨，人力、环保等多种开支也呈增长趋势，造成核黄素生产成本不断上升。因此，进一步改良核黄素生产菌种，降低发酵生产成本已成当务之急。 .本项目对枯草杆菌核黄素从头生物合成途径的26个基因进行结构优化和化学合成，以T7启动子和终止子控制每个基因的表达，通过改良的“重叠延伸PCR”技术实现26个基因原核表达单元的拼接，并最终创制了含有4个功能模块的26个基因原核表达单元的大肠杆菌从头合成核黄素工程菌株。.随后本研究开展了T7RNAP表达单元的DNA重排，获得了核黄素生物合成显著提高的突变单元lacPol1a，序列分析显示其中LacI带有两个位点突变（S93L和S288L），推测lacI发生了超级阻遏突变。之后又对T7Guarib进行了长DNA重排，通过筛选获得了核黄素生物合成增加的突变人工操纵子T7Guaribm，并完成了全序列分析，观测到BsGuaAS、BsGuaBS、BsGMPKS、BsNDKS、BsRibAS、 BsRibBS和 BsRibGS 7个基因内部存在突变,共产生了9个编码氨基酸的改变。本课题还开展了大肠杆菌σ因子EcRpoD基因重排和定向筛选，获得了提高核黄素生物合成的EcRpoD突变基因。 .最后将含有这些突变位点的重组载体转入BL21(DE3)获得了改良的工程菌株并进行了5立升发酵罐进行发酵实验，采用两因素三水平的中心组合实验设计（CCD）以及流加培养基的方式补料维持葡萄糖浓度（5g/L），同时优化不同氧传递系数，结果表明含有上述突变位点的大肠杆菌工程菌株的核黄素产量最高可达到20.21g/L。本项目为合成生物学在维生素生物制造上的应用奠定了技术基础。