叶绿体DNA向核基因组转移的机制研究

Endosymbiotic gene transfer from cytoplasmic organelles (chloroplasts and mitochondria) to the nucleus is a very important mechanism, and it is ongoing in land plants. Although the frequency of organelle DNA migration is high, mechanism that organellar DNAs integrate into nuclear genome are poorly understood. Mitochondrial DNA is reported to insert into nuclear genome through DNA Double-strand break (DSB) repair in tobacco. Our bioinformatic analysis shows that nonhomologous end joining (NHEJ) is also involved in chloroplast DNA incorporation during DSBs repair. However direct experimental evidence of chloroplast DNA insertion through DSB repair is lacking and it is necessary to design experiments to test this hypothesis. A reporter system is constructed in tobacco by us to monitor the DSB repair introduced chloroplast integration. Next the DNA methylation statuses and histone modification of the de novo chloroplast integrants will be studied by high throughput sequencing and biochemistry methods. Findings of this proposal will further our understanding on the evolution of nuclear and organellar genomes.

从细胞器（叶绿体和线粒体）到细胞核的内共生基因转移是一个非常重要的机制，在高等植物里这种转移一直在进行。尽管细胞器DNA迁移到细胞核的频率非常高，但是它们插入细胞核基因组的机制还不清楚。线粒体DNA在烟草里被报道能够通过DNA双链断裂修复插入到核基因组。我们的生物信息学分析表明叶绿体DNA也可以在DNA损伤修复时通过非同源末端连接插入到细胞核基因组,但是还没有直接的实验证据表明DNA损伤修复可以介导叶绿体DNA插入，因此很有必要设计实验来检测这个假设。我们在烟草里构建了一个可以检测DNA双链断裂修复引入的叶绿体DNA插入的报告系统，然后结合高通量测序和生物化学的手段研究新插入叶绿体DNA片段甲基化和组蛋白水平的修饰。该项目结果可以帮助我们深入理解细胞核和细胞器基因组的进化。

本项目完成了: . (1) 叶绿体DNA向核基因组转移的机制研究。. 发现a)DNA双链损伤效率增加会提高叶绿体DNA向细胞核转移的频率;b) 叶绿体DNA通过DNA双链损伤修复插入到细胞核基因组；c)叶绿体DNA插入片段具有遗传不稳定性，它们在后代会出现序列删除。. (2) 叶绿体DNA插入片段的甲基化分析和small RNA测序。. 我们通过重亚硫酸测序PCR，在叶绿体DNA插入片段上检测到CG、CHG和CHH水平的甲基化。分别提取含有叶绿体DNA插入片段和野生型植株的RNA,进行small RNA测序分析发现了覆盖插入片段的small RNA，这就暗示small RNA介导了叶绿体DNA插入片段的de novo甲基化。. (3)烟草细胞核基因组17kb新插入叶绿体DNA片段的甲基化和相关small RNA分析。. 对植物里目前唯一一个已知全长序列的17kb新插入叶绿体DNA片段进行了DNA甲基化测序分析，发现叶绿体来源的DNA片段在CG，CHG和CHH水平都有不同程度的甲基化。与基因间序列相比，启动子区域包括35S启动子和叶绿体psbA启动子的甲基化程度较低。small RNA测序结果表明含有该插入片段的植株在该区域有21-24nt的small RNA，且其分布情况与野生型烟草不同。. (4) 拟南芥细胞核基因组里不同插入时期叶绿体DNA片段的甲基化水平分析. 通过比较基因组学将拟南芥细胞核基因组里的叶绿体DNA片段插入发生在A. thaliana和A. lyrata两者分化的前后分为新、旧插入片段。在拟南芥Col背景下，对这些叶绿体DNA片段的甲基化测序数据进行分析发现旧插入片段的甲基化水平明显比新插入片段高，进一步分析发现旧插入片段在CG，CHG和CHH甲基化水平都显著地比新插入片段高，表明随着时间的推移叶绿体插入片段的甲基化水平上升。对这些区域small RNA水平进行分析发现新插入片段的21 nt small RNA水平比老插入片段高，但是22、23和24 nt的small RNA在新旧插入片段上没有显著区别。. 上述结果将有助于我们深入地理解细胞核和细胞器基因组的进化。