自噬及MicroRNA调控在过量氟致成釉细胞损伤中的作用及机制研究

Autophagy is the newly discovered cellular protection mechanism, which plays a significant role in maintaining cellular homeostasis, clearing and degrading unfolded proteins. The researches have reported that autophagy can be activated by target of rapamycin dependent pathway and independent pathway in cell stress. In the previous study, we found that dental fluorosis may be owing to endoplasmic reticulum stress of ameloblasts induced by excessive fluoride,leading to amelogenin aberrant degradation. Furthermore, the follow-up studies have found that the expressions of LC3 and Beclin1, rat ameloblast autophagy signal pathway marker molecules, was up-regulated by the increasing of fluoride in the certain fluorine concentration while the negative regulator mTOR was down-regulated, illustrating autophagy exists in dental fluorosis. Based on previous results, this study explores: (1) the pathways to autophagy in ameloblasts induced by fluoride in vitro and in vivo; (2) microRNA expression in ameloblasts with fluoride by high-throughput technique. Then we will explore whether microRNAs participate in the ameloblasts autophagy and regulation processes by taking miRNA-214 as a clue. We expect that the results can produce a new breakthrough in the pathogenesis of fluorosis.

自噬作为新近发现的细胞保护机制，在维持细胞内环境稳态，清除和降解异常折叠蛋白质方面发挥重要作用。研究发现，细胞在应激的条件下会通过雷帕霉素靶蛋白依赖性途径和非依赖性途径激活自噬。本课题组在上一个基金的研究中发现，氟牙症的发生可能是过量氟导致成釉细胞产生内质网应激，釉原蛋白降解障碍所致。接续的研究又发现，在一定的氟浓度范围内，大鼠成釉细胞自噬信号通路标志分子LC3、Beclin1等的表达随着氟浓度的增加而增高，而负调节因子mTOR表达降低，提示氟牙症形成过程中自噬反应的存在。在此基础上，本研究拟采用细胞培养和整体动物实验，深入探索自噬在氟致成釉细胞应激损伤后的作用及途径；应用高通量技术检测氟作用下成釉细胞microRNAs表达的变化，并以microRNA-214为线索，验证microRNA是否参与到成釉细胞自噬过程及其调控作用，期望本课题能在氟牙症的发病机制研究领域产生新突破。

自噬作为新近发现的细胞保护机制，在维持细胞内环境稳态，清除和降解异常折叠蛋白质方面发挥重要作用。研究发现，细胞在应激的条件下会激活自噬。本课题组在上一个基金的研究中发现，在一定的氟浓度范围内，大鼠成釉细胞中自噬信号通路标志分子LC3、Beclin1等的表达随着氟浓度的增加而增高，而负调节因子mTOR表达降低，提示氟牙症形成过程中自噬反应的存在。在此基础上，本研究通过细胞培养和整体动物实验，采用CCK8、透射电镜、Western blot、Real-time PCR、免疫组化、免疫荧光、双串联荧光、共聚焦显微镜等技术，通过观察氟中毒成釉细胞中自噬相关因子表达水平、细胞微观结构变化和细胞凋亡水平，探讨氟对成釉细胞自噬流的影响及可能的机制。研究结果显示，过量氟使LS8细胞中LC3和p62表达增高，细胞出现自噬体增加，线粒体和内质网肿胀，细胞凋亡增加，同时发现mTOR、PI3K、AKT蛋白磷酸化水平增高；加入Baf A1后细胞中LC3表达进一步增高，与饥饿组对比，双荧光串联结果提示氟处理后细胞中GFP/RFP比值升高；另外，mTOR特异性抑制剂雷帕霉素可以增加氟中毒成釉细胞中LC3表达水平，而降低p62表达水平，细胞中GFP/RFP比值也降低，此时细胞生长状态有所恢复；利用3-MA抑制大鼠成釉细胞自噬后，细胞凋亡明显增加。以上结果证实了过量氟会诱导成釉细胞自噬体合成，同时抑制自噬体降解过程，这个过程可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控，导致细胞微观结构受损，细胞凋亡明显增加，而雷帕霉素可以通过恢复自噬流水平来减轻过量氟导致的成釉细胞损伤，自噬在过量氟处理下保护成釉细胞免受凋亡方面发挥了重要作用。此外，我们利用miRNA-seq的方法得到了过量氟处理的LS8细胞和氟中毒大鼠胚胎成釉器中miRNA表达谱的变化，通过交叉比对和同源性分析发现miR-296-5p是氟中毒过程中与自噬相关、且高度保守的miRNA；通过转染miR-296-5p模拟物和应用AMPK通路抑制剂Compound.C后发现，miR-296-5p过表达引起氟中毒LS8细胞中AMPK和ULK1蛋白磷酸化增加，同时LC3和Beclin1蛋白表达增加，细胞中绿色荧光淬灭，GFP/RFP比值降低；Compound.C抑制AMPK/ULK1通路后，细胞自噬水平下降，提示miR-296-5p可能通过AMPK/UL