自噬在氟骨症发病机制中的作用

The mechanism of how osteoblasts were activated and how apoptosis was induced is a key issue to be solved in the pathogenesis of endemic fluorosis. In previous research, we found that the proteins related to endoplasmic reticulum stress including BiP, PERK, ATF6 and IREI　increased in osteoblasts and mouse exposure to fluoride. The expression of autophagy related genes p62 and LC3-Ⅱ were up-regulated in fluorosis osteoblasts, which provided a new clue to answer the above questions. Through culturing osteoblasts in the presence of fluoride in vitro, combined with fluorosis animal, the aim of our study is going to observe the expression of autophagy related genes including p62 and LC3-II, and to detect the changes of regulatory factors related to osteoblast proliferation and differentiation. We will analyze the effect of autophagy on osteoblast proliferation, differentiation and apoptosis. The role of autophagy in osteoblast activation and bone turnover acceleration induced by fluoride will be discussed. This project will be helpful to find new factors and signaling pathway in skeletal fluorosis never studied before, and will provide new insights into the prevention strategies of skeletal fluorosis.

氟中毒时成骨细胞如何被激活、细胞凋亡如何产生，是氟骨症发病机制中亟待解决的关键问题。前期工作发现，氟骨症大鼠骨组织和染氟成骨细胞中内质网应激相关基因BiP、PERK、ATF6和IRE1表达增多，且染氟成骨细胞中自噬相关基因p62和LC3-Ⅱ的表达上调，提示自噬可能介导氟骨症的发生发展。本项目拟体外培养成骨细胞染氟并结合整体氟中毒动物实验，观察自噬相关基因p62、LC3-II的表达变化，分析其与成骨细胞增殖、分化和凋亡的相互关系，探讨自噬在氟作用下成骨细胞增殖和凋亡中的作用；检测与成骨细胞增殖、分化等相关的调控因子的变化，阐明自噬通过哪些因素介导氟中毒骨病变的发生、发展。本项目的完成有助于发现以往氟骨症机制研究从未涉及的新的因子和信号通路的重要作用，为氟骨症防治策略提供新的思路和理论依据。

慢性氟中毒时成骨细胞功能如何异常、因何导致骨质疏松，是地方性氟中毒发病机制中亟待解决的关键问题。本项目通过复制氟骨症大鼠动物模型和成骨细胞株染氟体外模型，观察自噬在氟骨症发生机制中的作用。通过灌胃给氟在体内成功复制大鼠氟骨症病变，成骨因子ALP、osterix和Runx2与破骨因子TRACP和RANKL在股骨和血清中表达明显升高，呈现骨转换加速的特征，晚期骨密度降低表现为骨质疏松。投氟之后大鼠股骨p62降低而LC3-II升高，表明自噬明显增强，与成骨活性增强变化方向一致。腹腔注射雷帕霉素抑制mTOR诱导自噬，发现在自噬增强的同时，成骨转录因子的活性也明显增强，表明氟骨症出现的骨转换加速与骨组织内引发的自噬尤其是mTOR信号通路有着密切联系。体外实验采用MC3T3-E1成骨细胞系进行雷帕霉素、氯喹、染氟和染氟联合雷帕霉素条件下自噬与成骨相关因子的变化研究。结果显示雷帕霉素靶向抑制mTOR的磷酸化，增强成骨细胞内自噬，同时早期即可促进成骨细胞内标志物ALP、osterix和Runx2的表达，晚期导致明显矿化结节的形成。氯喹作为自噬抑制剂明显减弱了成骨细胞内自噬，同时细胞增殖和分化能力也明显下降，说明自噬与成骨细胞的增殖和分化能力变化具有同向性。染氟早期表现为在低浓度时促进细胞增殖、自噬和分化而高浓度时抑制。染氟条件下添加雷帕霉素，可协同低氟条件对成骨细胞自噬和分化活性的诱导，同时拮抗高氟对细胞的抑制，通过靶向阻断mTOR激活自噬，抑制凋亡基因Bax和Pro-caspase-3活化,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达保证细胞周期顺利进行，同时促进细胞的分化和成熟。研究成果表明自噬尤其mTOR信号通路在氟诱导成骨细胞活性和功能方面的重要作用，在过量氟早期和晚期诱导成骨活跃机制中扮演着重要角色。本项目的完成对阐明氟骨症的发病机制具有一定的意义，为氟骨症防治策略提供新的思路和理论依据。