补体C3a、C5a介导足细胞损伤在局灶节段性肾小球硬化中的作用研究

Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is the most common type of refractory nephrotic syndrome, characterized by long term steroid treatment, resistance to steroid and poor prognosis. Pathogenesis of focal segmental glomerulosclerosis has not been well defined. Current studies focused on injury and lost of podocytes caused by non-immune factors, such as genetic mutations, permeability factors, and mechanic stress. However, it has been reported that the most common pathological pattern of C1q nephropathy was FSGS, indicating the close correlation between complement activation and FSGS. Several evidences from recent studies on FSGS patients supported that complement activation contributed to the pathogenesis of FSGS. C3a and C5a are key pro-inflammatory products of complement activation. Their roles in FSGS remain poorly defined. Our study found that the expression of receptors of C3a and C5a were enhanced in the podocytes of FSGS patients. This study aim to explore the roles of C3a and C5a in the pathogenesis of FSGS by immunohistochemistry, confocal microscopy, western blot, ELISA and RT-qPCR, using kidney tissues from FSGS patients, C3aR/C5aR knockout FSGS mouse models in vivo and podocytes in vitro. It is expected that this study will lay the foundation for new therapeutic targets of FSGS.

局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）是难治性肾病综合征最常见类型，激素治疗时间长、抵抗率高，往往进展为终末期肾衰竭。目前FSGS发病确切机制尚不清楚，现有研究主要聚焦在遗传突变、循环渗透因子、机械应力等非免疫因素导致的足细胞损伤与丢失。文献报道多数C1q肾病患者病理表现为FSGS，近期研究显示FSGS患者的尿液及肾组织存在补体激活的证据，提示补体激活与FSGS发生有关。C3a、C5a是补体活化的关键致炎效应分子，其在FSGS中的作用国内外未见报道，本项目组前期工作发现FSGS患者肾组织足细胞上C3a、C5a受体表达增强，因此本项目进一步利用FSGS患者肾组织、C3aR/C5aR单双基因敲除FSGS小鼠模型及培养足细胞进行体内、外实验，阐明C3a、C5a介导的足细胞损伤在FSGS中的作用，为寻找FSGS治疗新靶点提供理论依据。

项目背景：局灶节段性肾小球硬化（FSGS）是难治性肾病综合征最常见类型，激素治疗抵抗率高，往往进展为终末期肾衰竭。目前FSGS发病机制尚不完全清楚，近期研究提示补体激活与FSGS发生有关。C3a、C5a是补体活化的关键致炎效应分子，其在FSGS中的作用国内外尚未见报道。主要研究内容：本研究利用FSGS患者肾组织、C3aR/C5aR基因敲除小鼠FSGS肾病模型及人足细胞进行体内、外实验，用免疫组化、Western blot、ELISA及RT-qPCR等技术，从不同层面阐明C3a、C5a在FSGS发病机制中的作用及其机制。研究结果：与正常对照相比，FSGS肾病患者肾组织足细胞上可见C3a、C5a及其受体C3aR、C5aR表达显著增强，且与尿蛋白及肾功能正相关。各型FSGS患者血尿C3a、C5a水平较正常对照显著升高（P<0.05），不同病理分型患者间无差别（P>0.05）。FSGS患者尿液C3a、C5a水平与尿蛋白及肾功能正相关（P<0.05），但血清C3a、C5a水平与尿蛋白及肾功能不相关（P>0.05）。利用阿霉素静脉注射建立FSGS小鼠模型，分别于第1、4、8、12周收集血尿标本，C3aR及C5aR基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，第1周起蛋白尿显著减少（P<0.05），低白蛋白血症及高脂血症减轻（P<0.05)，第8周起血清肌酐升高程度明显减轻（P<0.05），第4周起肾脏病理足细胞增生、肥大和脱落表现减轻，球性硬化肾小球数目减少，WT1免疫组化显示足细胞数量减少程度减轻（P<0.05），RT-qPCR显示足细胞标记蛋白nephrin、podocin mRNA表达下调程度显著减轻（P<0.05），第8周起nephrin、podocin 蛋白表达水平下调程度同样减轻（P<0.05）。在培养的人足细胞，C3a、C5a刺激引起nephrin、podocin mRNA及蛋白表达水平下调（P<0.05），同时足细胞信号通路蛋白β-catenin mRNA及蛋白表达也下降（P<0.05）。科学意义：本项目首次在FSGS患者上证明了C3a、C5a及其受体的表达与病情活动的相关性，进一步在动物模型上发现C3aR、C5aR敲除对FSGS小鼠足细胞损伤的保护作用，在细胞实验中探讨了C3a、C5a刺激对足细胞表型及功能的影响及其分子机制，为补体调节药物在难治性FSGS应用奠定了理论基础。