自噬对七氟醚致神经细胞损伤的保护作用分子机制

The long-term objective of this young investigator NSFC application is to explore the mechanisms of embryotoxicity of the anesthetics to provide a basis for developing intervention approaches. Sevoflurane is one of the most commonly used anesthetic agents in the clinic, and is often used for fetal operations in gestational period, non-obstetric operations in gestational period, and infant operations and neonate operations. There is a serious concern over its effects on embryo and neonate neural development. Recently it is found that inhalation anesthetics cause nerve injury, but the mechanism of action is still not clear. We have recently accomplished the toxicology research about neural cell caused by isoflurane for several years and found that isoflurane exerts cytotoxic effect, which can be attributed to the regulation of calcium homeostasis through inhibition of inositol-1,4,5-trisphosphate receptor.Suitable autophagy by up-regulation may rotect cell from damage. The central hypothesis is that molecule mechanism of neuropathy induced by sevoflurane is via regulation of autophagy and JNK pathway. We will explore how JNK signaling pathway regulates autophagy and apoptosis of neuropathy induced by sevoflurane at cell, molecule and animal model levels. Experimental methods include advanced molecule and morphology technology, such as flow cytometry, transfection, Western bloting and electron microscopy,etc. We expect that results of the research will provide evidence for neuroprotection and damage restoration during neuron growth in perinatal period operation.

本项青年基金课题的长期目标是探讨麻醉药胚胎毒性机制，为发展防治手段提供理论基础。七氟醚是临床上常用的麻醉药，多用于妊娠期胎儿手术、妊娠期非产科手术、婴幼儿和新生儿手术，其对胚胎及新生儿神经发育的影响倍受关注。近期的研究发现，吸入麻醉药引起神经损伤，但作用机制仍未完全阐明。申请人近几年完成的异氟醚对神经细胞的毒理研究，发现异氟醚通过干扰细胞钙稳态产生细胞毒性反应,而此类毒性可被InsP3受体抑制剂控制，合适的上调自噬可保护细胞免于损伤。根据已有的发现，我们提出的中心假说是七氟醚引起神经损伤的分子机制是通过自噬与JNK 通路的调控。我们将从细胞，分子，和动物模型水平来探讨JNK信号通路是如何调节七氟醚所致神经细胞损伤时的自噬与细胞凋亡。实验手段采用分子和形态学等先进技术，包括流式转染、蛋白印迹和电镜观察等。我们预期本课题的结果会为临床上围产期手术药物使用及发育中神经保护与损伤修复提供理论依据。

背景 探讨不同浓度七氟烷对大鼠胚胎神经干细胞(Fetal neural stem cells,FNSC)的活性、增殖及分化的影响，并初步探索其机制，为临床上七氟烷运用的选择和管理提供一定的指导意义。方法： 所有实验均选用第2-4代FNSC进行，选用胚胎神经干细胞标记物Nestin以及Sox2进行免疫荧光鉴定，可知培养的第4代FNSC未分化表型仍维持在90%以上。实验组分为：低浓度七氟烷组，中浓度七氟烷组以及高浓度七氟烷组。FNSC于处理6h，12h及24h后用MTT方法检测FNSC活细胞数的变化。利用Annexinn V/PI流式细胞术检测SH组处理不同时间对FNSC细胞凋亡的影响，Western blotting法检测cleaved caspase-3以及bcl-2和bax的水平，采用EdU插入实验检测C组、SL组、SM组以及SH组暴露6h对FNSC增殖的影响；另一批FNSC于药物处理结束后继续培养24h，采用Sox2免疫荧光染色检测七氟烷对FNSC分化的影响。利用Western blotting法检测SH组处理不同时间后FNSC中p-JNK以及JNK蛋白表达变化，推测七氟烷对FNSC的活性、增殖影响的可能机制。结果： 与C组相比，SL组处理不同时间后FNSC细胞活性无明显影响；SM组24h可诱导FNSC活细胞数降低，有显著性差异；SH组暴露6h、12h以及24h均可诱导FNSC活细胞数降低，且呈时间依赖性，有统计学意义。 与C相比，SH组处理12h、24h可诱导凋亡细胞增加，有统计学差异，SH各时间组之间比较均有统计学差异；SH各时间组与C组比较cleaved caspase-3蛋白表达水平增加，bcl-2/bax水平降低，有统计学意义。 与C组相比，SL组以及SM组暴露6h对FNSC的增殖和分化无显著影响，而SH组6h可抑制FNSC的增殖，诱导其自发分化，差异有统计学意义。与C组相比，SH组可上调p-JNK蛋白表达水平，而对总的JNK蛋白无明显影响，p-JNK/JNK比例呈时间依赖性增加，有统计学差异。结论： 七氟烷高浓度组呈时间依赖性的诱导FNSC凋亡，并抑制其增殖，诱导其自发分化，而低、中浓度组并无此作用；七氟烷的浓度依赖性仅在细胞活力上有所体现；七氟烷对FNSC活性、增殖的影响可能与激活JNK途径有关。