携载CRISPR-Cas13a 生物合成囊泡在乳腺癌诊疗一体化中的实验研究

Breast cancer is the most common malignancy in women worldwide. Evidences demonstrated gas vesicles produced by some floated microorganisms can be served as ultrasound contrast agents. MicroRNA-155 (miR-155), a well-known oncogenic microRNA, is overexpressed in many human cancers including breast cancer, and could be used as a target for the treatment of breast cancer. CRISPR-Cas13a can be engineered for mammalian cell RNA knockdown. In this study, we use iRGD to modify the gas vesicles produced by some floated microorganisms such as halophilic archaea and cyanobacteria to produce targeted nano-ultrasound contrast agent for accurate imaging of breast cancer. Meanwhile, cationic vesicles were modified by polyethylenimine (PEI) to form cationic vesicles, which can target delivery CRISPR-Cas13a to the tumor site. Combined with ultrasound targeted microbubble blasting technology, the nano-system can realize directional controlled release of CRISPR-Cas13a. Our study will provide a novel idea to for the integrated research of diagnosis and treatment of breast cancer patients.

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤。研究表明，某些浮游微生物产生的气体囊泡可用于超声造影剂。癌基因MicroRNA-155 (miR-155) 在包括乳腺癌在内的许多癌症中都存在着过表达，可以作为乳腺癌治疗的靶点。CRISPR-Cas13a 可以靶向敲除哺乳动物细胞中 RNA。本研究拟利用iRGD 修饰来源于嗜盐古菌、蓝藻等浮游微生物的气体囊泡，制成靶向纳米超声造影剂，对乳腺癌进行精准显像，同时表面用PEI将其修饰成阳离子囊泡，靶向递送可以沉默miR-155的CRISPR–Cas13a 至肿瘤部位，联合超声靶向微泡爆破技术实现CRISPR–Cas13a的定向控释来精准治疗乳腺癌，以期为乳腺癌患者的诊疗一体化研究提供新的思路。

肿瘤是一个严重的全球公共卫生问题。随着医学多学科研究的发展，出现了许多新的癌症治疗方法，如基因编辑、光动力疗法和免疫代谢治疗等。然而，如何将治疗药物安全有效递送至肿瘤部位也是一个难题。近年来生物囊泡（微生物囊泡、外泌体囊泡）由于具有高的循环稳定性、低免疫原性和主动靶向能力等优良特性，受到了广泛关注。基于此，我们开展了以下工作：.1.从浮游微生物提取气体囊泡，表面用PEI修饰后负载靶向敲除Cdh2基因的CRISPR/Cas9质粒，合成囊泡载药体系（GVs-PEI-CRISPR/Cas9）。联合超声靶向微泡爆破技术实现CRISPR/Cas9的定向控释来精准治疗乳腺癌。结果显示：气体囊泡的粒径约260 nm。通过气体囊泡介导的sgRNA传递，我们成功地敲除了上皮-间充质转化（EMT）相关基因Cdh2。在体外和在体内引入cdh2缺失的细胞后，其侵袭和转移程度明显减少。考虑到超声的无创性、靶向性和可重复性等优点，未来在体内条件下的原位基因编辑可能采用气体囊泡介导的靶向传递技术。.2.利用肿瘤细胞来源的外泌体囊泡负载AIE分子制备纳米药物DES。联合地塞米松通过改善肿瘤微环境局部缺氧，提高光动力疗效。结果显示：外泌体大小约150 nm。DES纳米囊泡可靶向肿瘤组织。地塞米松联合DES纳米囊泡介导的光动力治疗可有效抑制肿瘤生长。这项工作为未来外泌体与AIE的联合应用研究提供思路。.3.利用肿瘤细胞来源的外泌体囊泡负载POM1和二甲双胍制备纳米药物C-PMet。.结果显示：C-PMet可以增加eATP的水平，同时防止免疫抑制腺苷的积累和减轻缺氧。升高的eATP触发p2X7-nlrp3炎症小体的激活，驱动巨噬细胞焦亡，增强树突状细胞（DCs）的成熟和抗原能力，以增强T细胞和自然杀伤细胞（NK）的细胞毒性功能。这项研究为推进eATP驱动的抗肿瘤免疫提供了一种创新的策略。